血清miR-221、miR-193a-5p與卵巢上皮癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

李軍 韓玲 董力 劉書磊

卵巢上皮癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的腫瘤之一，是全世界死亡率最高的婦科惡性腫瘤，在女性癌癥死亡原因中排第四位[1]。卵巢上皮癌占卵巢惡性腫瘤85%～90%，最為常見(jiàn)，由于卵巢上皮癌在發(fā)病早期沒(méi)有特殊癥狀，因此大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期或者已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此具有較高的死亡率[2,3]。微小核糖核酸(microRNA，miR)是一種長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸序列的調(diào)節(jié)性非編碼RNA調(diào)節(jié)分子，主要通過(guò)與目的mRNA相互作用來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)[4]，廣泛存在于真核生物中，其主要參與人類將近1/3的基因表達(dá)調(diào)控[5]。miR-221在多種腫瘤中均存在異常表達(dá)，有研究表明miR-221在肝癌[6]、結(jié)腸癌[7]、卵巢癌[8]等多種癌癥中均高表達(dá)；miR-221能夠通過(guò)靶向p57、p27等相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)調(diào)控前列腺癌的細(xì)胞周期[9]。有研究表明miR-193a-5p在膀胱癌[10]、食管鱗狀細(xì)胞癌[11]、非小細(xì)胞肺癌[12]等癌癥中均存在異常表達(dá)。本研究主要通過(guò)檢測(cè)卵巢上皮癌患者血清中miR-221、miR-193a-5p的表達(dá)水平，并分析miR-221和miR-193a-5p與患者的預(yù)后和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為卵巢上皮癌的診斷和治療提供參考價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月至2015年7月西寧市第二人民醫(yī)院收治的97例卵巢上皮癌患者(卵巢上皮癌組)，同期收集97例健康志愿者作為對(duì)照組。本研究中97例卵巢上皮癌患者，年齡36～73歲；<60歲58例，≥60歲39例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期23例，Ⅲ+Ⅳ期74例；低分化患者41例，中高分化患者56例；腫瘤大?。?2 cm患者48例，≥2 cm患者49例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者52例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者45例。本研究通過(guò)西寧市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：所有卵巢上皮癌患者的診斷以病理組織學(xué)診斷為依據(jù)，且患者均未接受過(guò)放療或者化療，臨床資料齊全，患者簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：排除其他部位腫瘤、內(nèi)分泌疾病、高血壓等疾病以及近期進(jìn)行手術(shù)治療的患者；隨訪資料不完整。

1.3 試劑與儀器 miR-221和miR-193a-5p以及內(nèi)參引物均由上海捷瑞生物有限公司合成；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購(gòu)于諾唯贊生物有限公司；主要儀器：美國(guó)ABI7500熒光定量PCR儀，美國(guó)Thermo公司離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司-80oC冰箱。

1.4 樣本采集及檢測(cè) 健康志愿者于體檢當(dāng)日采集空腹靜脈血5 ml，卵巢上皮癌患者于住院次日采集空腹靜脈血5 ml均放至促凝管中，溫度4℃，1 600 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行分裝標(biāo)記，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 總RNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol試劑提取患者血清中的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。運(yùn)用SYBR Green(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件為：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)。U6正向引物：5’-CTT CGG CAG CAC ATA TAC T-3’，U6反向引物5’-AAA ATA TGG AAC GCT TCA CG-3’；miR-221正向引物：5’-CAG CAT ACA TGA TTC CTT GTG A-3’，miR-221反向引物5’-CTT TGC TGT TTG AGA TGT TTG G-3’；miR-193a-5p正向引物：5’-TGG GTC TTT GCG GGC-3’，miR-193a-5p反向引物5’-GAA TAC CTC GGA CCC TGC-3’。反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用儀器配套軟件進(jìn)行Ct值計(jì)算，與內(nèi)參U6Ct值進(jìn)行比值計(jì)算miR-221和miR-193a-5p的相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 隨訪 通過(guò)電話或者門診復(fù)查的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，2～3個(gè)月隨訪1次，隨訪時(shí)間為患者確診后1～60個(gè)月，患者死亡停止隨訪。

2 結(jié)果

2.1 2組血清miR-221、miR-193a-5p表達(dá)水平比較 卵巢上皮癌組血清中miR-221、miR-193a-5p相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組血清miR-221、miR-193a-5p表達(dá)水平比較

2.2 卵巢上皮癌患者血清miR-221、miR-193a-5p表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 卵巢上皮癌患者血清中miR-221的表達(dá)水平與臨床分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、腫瘤大小、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)；miR-193a-5p表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與患者年齡、臨床分期、腫瘤大小、分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 卵巢上皮癌血清中miR-221和miR-193a-5p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 卵巢上皮癌患者血清miR-221、miR-193a-5p水平與患者預(yù)后的關(guān)系

2.3.1 單因素分析miR-221對(duì)預(yù)后的影響：以中位數(shù)為界，將卵巢上皮癌患者分為miR-221高表達(dá)組(n=49例)和miR-221低表達(dá)組(n=48例)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-221高表達(dá)組與低表達(dá)組術(shù)后5年生存率分別為26.53%(13/49)、33.33%(16/48)，術(shù)后生存時(shí)間分別為(29.74±1.98)個(gè)月、(34.83±2.12)個(gè)月，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank 2=-13.110，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-221水平對(duì)卵巢上皮癌預(yù)后的影響

2.3.2 單因素分析miR-193a-5p對(duì)預(yù)后的影響：以中位數(shù)為界，將卵巢上皮癌患者分為miR-193a-5p高表達(dá)組(n=49例)和miR-193a-5p低表達(dá)組(n=48例)。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-193a-5p高表達(dá)組與低表達(dá)組的術(shù)后5年生存率分別為20.41%(10/49)、31.25%(15/48)，術(shù)后生存時(shí)間分別為(25.57±1.90)個(gè)月、(32.90±2.06)個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank 2=-18.205，P=0.000)。見(jiàn)圖2。

2.4 血清miR-221、miR-193a-5p聯(lián)合檢測(cè)對(duì)卵巢上皮癌的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-221、miR-193a-5p的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.824、0.801。血清miR-221、miR-193a-5p聯(lián)合檢測(cè)具有較好的卵巢上皮癌診斷價(jià)值，聯(lián)合應(yīng)用的敏感度、特異度分別為0.810、0.843。

圖2 血清miR-193a-5p水平對(duì)卵巢上皮癌預(yù)后的影響

3 討論

卵巢上皮癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的死亡率和較低的5年生存率，由于缺乏早期、安全和非侵入性檢測(cè)方法，加之卵巢上皮癌患者在發(fā)病早期沒(méi)有明顯癥狀，因此，大部分患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于癌癥晚期[2,3]。因此，尋找卵巢上皮癌的腫瘤生物標(biāo)志物，為卵巢上皮癌提供早期的診斷依據(jù)成為當(dāng)今研究的重中之重[13,14]。研究表明miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，眾多miRNA能夠作為多種癌癥診斷和預(yù)后判斷的生物指標(biāo)[15,16]。在卵巢上皮癌中，血清中的miRNA對(duì)于癌癥的判斷具有重要的臨床意義，如miR-17-5p、miR-221-5p、miR-23a在卵巢上皮癌的診斷中發(fā)揮重要的價(jià)值[17]。因此，尋找特異性的卵巢上皮癌的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，能夠?yàn)槁殉采掀ぐ┑脑\斷和檢測(cè)提供新的潛在分子標(biāo)志物。

miRNA是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)節(jié)性的非編碼RNA分子，miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，miRNA與細(xì)胞的增殖分化、凋亡等有關(guān)[4,5]。miR-221參與調(diào)控一系列生物活動(dòng)，如血管生成、細(xì)胞增長(zhǎng)和凋亡等，其在肝癌、胰腺癌、卵巢上皮癌、卵巢癌等癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18,19]；miR-221可以通過(guò)對(duì)GHR、PUMA、Bmf、DDIT4等癌基因的調(diào)控來(lái)影響細(xì)胞的增殖分化和凋亡，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9,20]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-193a-5p在胃癌組織中表現(xiàn)為低表達(dá)，可以作為胃癌診斷的潛在生物標(biāo)志物[21]；有報(bào)道m(xù)iR-193a-5p在非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等癌癥中均存在異常表達(dá)[10-12]，同時(shí)miR-193a-5p在一組被診斷為慢性髓系白血病的南非患者中亦存在表達(dá)[22]。

本研究結(jié)果顯示，和健康志愿者對(duì)比，miR-221和miR-193a-5p在卵巢上皮癌患者血清中的表達(dá)水平升高。通過(guò)對(duì)卵巢上皮癌患者的臨床參數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明卵巢上皮癌患者miR-221血清表達(dá)水平與臨床分期有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。在卵巢上皮癌中miR-221出現(xiàn)高表達(dá)時(shí)，患者具有較晚的臨床分期，表明miR-221在卵巢上皮癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮促癌作用。同時(shí)預(yù)后結(jié)果顯示，miR-221高表達(dá)的患者具有較差的預(yù)后和術(shù)后生存率，可以作為卵巢上皮癌患者預(yù)后判斷的一項(xiàng)指標(biāo)。血清miR-193a-5p的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者年齡、臨床分期、腫瘤大小、分化程度無(wú)關(guān)。在卵巢上皮癌中，當(dāng)miR-193a-5p高表達(dá)時(shí)，患者有明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表明miR-193a-5p也主要發(fā)揮促癌作用。同時(shí)預(yù)后結(jié)果顯示，miR-193a-5p高表達(dá)的患者具有較差的預(yù)后和術(shù)后生存率，同樣可作為卵巢上皮癌患者預(yù)后判斷的一項(xiàng)指標(biāo)。

通過(guò)ROC曲線結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-221、miR-193a-5p的AUC分別為0.824、0.801，二者表達(dá)水平均有助于對(duì)卵巢上皮癌患者和健康志愿者進(jìn)行區(qū)分，二者可以作為卵巢上皮癌患者和健康志愿者的潛在鑒別指標(biāo)。血清miR-221、miR-193a-5p聯(lián)合檢測(cè)后對(duì)卵巢上皮癌診斷的靈敏度和特異度分別為81.0%和84.3%，與二者自身相比均明顯增高。因此，聯(lián)合檢測(cè)卵巢上皮癌血清中miR-221、miR-193a-5p表達(dá)水平可作為卵巢上皮癌診斷的潛在有效的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，miR-221、miR-193a-5p在卵巢上皮癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中主要發(fā)揮促癌的作用，聯(lián)合檢測(cè)血清miR-221、miR-193a-5p有助于卵巢上皮癌患者的診斷和預(yù)后評(píng)估，為血清miRNAs在卵巢上皮癌中的診斷應(yīng)用提供了一定的依據(jù)。