急性髓細(xì)胞白血病患者外周血單核細(xì)胞IL-9、STAT3和miR-21的表達(dá)及意義

陽(yáng)梅 嚴(yán)曉琴 冷亞美 賈永前

急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，Aml)以造血干(祖)細(xì)胞不受控制的增殖，蓄積于骨髓并抑制正常造血為主要特征，屬于血液系統(tǒng)多發(fā)惡性疾病[1]。受環(huán)境等各種因素的影響，Aml發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。隨著化療方案的不斷改進(jìn)和新藥的出現(xiàn)，Aml的治療較以往有了很大的改善，但Aml患者長(zhǎng)期無(wú)病生存率仍較低，治療失敗或復(fù)發(fā)的現(xiàn)象較為[2]。目前，對(duì)于Aml疾病的發(fā)生、診治等方面仍有許多未知問(wèn)題需要深入研究，探索新的分子學(xué)改變對(duì)其診斷、治療以及預(yù)后意義重大。本研究通過(guò)檢測(cè)Aml患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)IL-9、STAT3和miR-21mRNA表達(dá)以及IL-9和磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白表達(dá)，分析其表達(dá)對(duì)Aml疾病的臨床意義，以期為該疾病的診治和預(yù)后判斷提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年2月至2014年6月在我院住院治療的Aml患者120例為研究對(duì)象(Aml組)，其中男68例，女52例；年齡13～82歲，平均年齡(52.3±6.4)歲；診斷分型按FAB標(biāo)準(zhǔn)[3]，M0型11例，M1型18例，M2型46例，M3型19例，M4型17例，M5型9例。同時(shí)選取同時(shí)期的100例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男54例，女46例；年齡12～80歲，平均年齡(51.1±7.2)歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且受試者均簽署知情同意書(shū)。所有患者采用門(mén)診隨訪或電話隨訪的方式跟蹤隨訪5年。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自挪威Axis shield公司)；Trizol試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒(購(gòu)自大連TaKaRa有限公司)；IL-9、STAT3和miR-21引物序列(由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)；BCA蛋白試劑盒(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人IL-9多克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Bostre公司)；兔抗人STAT3單克隆抗體和小鼠抗人β-actin單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)abcam公司)；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)SANTA公司)。Bio-Rad Chromo4 RT-PCR儀(購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司)；Bio-6000凝膠電泳掃描儀(購(gòu)自上海中晶科技有限公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀(購(gòu)自北京六一儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集:采集所有受試者空腹靜脈血10 ml，肝素鈉抗凝。參照文獻(xiàn)方法[4]，采用密度梯度離心法分離PBMCs。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)IL-9、STAT3和miR-21 mRNA表達(dá):將分離的PBMCs用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，離心洗滌。加入Trizol裂解液并提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，再嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA行RT-PCR。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。內(nèi)參為GAPDH，mRNA的相對(duì)表達(dá)水平則采用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.3 Western blot法檢測(cè)IL-9和pSTAT3蛋白表達(dá):收集PBMCs加入RIPA裂解液，并在4℃條件下充分裂解30 min，離心10 min(12 000 r/min)，上清液即為蛋白，分裝于EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩CA法測(cè)定總蛋白濃度?；靹蜻m量蛋白提取液與5×SDS蛋白Loading buffer，在沸水浴條件下加入5 min，使其充分變性。待冷卻至室溫后，4℃條件下，12 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行電泳。電泳條件：5%濃縮膠，40 V，電泳40 min；10%分離膠，電壓100 V，電泳110 min。電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，采用5%脫脂奶粉在室溫中封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌后，加入二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌后加入ELC顯影液避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影。使用Image-Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參，各蛋白條帶與內(nèi)參的灰度值比值表示IL-9和pSTAT3蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 IL-9、STAT3和miR-21 mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，Aml組患者IL-9、STAT3和miR-21mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 IL-9、STAT3和miR-21 mRNA表達(dá)水平

2.2 IL-9和pSTAT3蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，Aml組患者IL-9和pSTAT3蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表3。

2.3 IL-9、STAT3和miR-21與Aml患者臨床參數(shù)的關(guān)系 分別依據(jù)IL-9、STAT3和miR-21 mRNA表達(dá)的均值1.89、2.34、2.13將其分為低表達(dá)和高表達(dá)。IL-9、STAT3和miR-21 mRNA表達(dá)與患者年齡、性別以及血紅蛋白均不相關(guān)(P>0.05)，與FBA分型、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓原始細(xì)胞相關(guān)(P<0.05)，IL-9與血小板計(jì)數(shù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4、5。

圖1 IL-9和pSTAT3蛋白表達(dá)

組別IL-9p-STAT3對(duì)照組(n=100)0.10±0.000.28±0.01Aml組(n=120)0.98±0.030.93±0.04t值293.221158.373P值0.0000.000

表4 IL-9、STAT3和miR-21 mRNA表達(dá)與Aml患者年齡、性別及FBA分型關(guān)系 例

表5 IL-9、STAT3和miR-21與患者臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.4 IL-9、miR-21和STAT3表達(dá)相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-9與miR-21、IL-9與STAT3以及miR-21與STAT3表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.467，P<0.05；r=0.527，P<0.05；r=0.483，P<0.05)。

2.5 IL-9、STAT3和miR-21表達(dá)與患者預(yù)后之間關(guān)系 Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，IL-9、STAT3和miR-21高表達(dá)患者DFS分別為39.24%、36.59%、34.57%，低表達(dá)患者DFS分別為53.66%、60.53%、64.10%。IL-9、STAT3和miR-21高表達(dá)患者DFS均較低表達(dá)患者顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.6 IL-9、STAT3、miR-21以及聯(lián)合診斷ALM的ROC曲線分析 IL-9、STAT3和miR-21 以及聯(lián)合診斷ALM的靈敏度分別為65.8%、74.2%、68.3%、82.5%，特異度分別為88.0%、80.0%、88.0%、95.0%，ROC曲線下面積分別為0.751、0.746、0.794、0.848。與IL-9、STAT3和miR-21單獨(dú)診斷ALM相比，三者聯(lián)合診斷ALM的靈敏度、特異度以及ROC曲線下面積均顯著提高(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

Aml作為一類惡性增殖性疾病，來(lái)源于髓系造血系統(tǒng)，因白血病細(xì)胞異常增殖，影響正常造血細(xì)胞生長(zhǎng)，使其受到抑制，甚至導(dǎo)致造血功能。目前，蛋白酶體抑制劑、Bcl-2抑制劑、免疫治療等藥物應(yīng)用在一定程度上提高Aml治療效果，但當(dāng)前除急性早幼粒細(xì)胞白血病外，其他亞型Aml仍無(wú)有效治愈方法。對(duì)此，需探尋新治療靶點(diǎn)，深入探究Aml發(fā)病機(jī)制，以求提高疾病治愈率。

圖2 IL-9、STAT3和miR-21表達(dá)與Aml患者預(yù)后的關(guān)系;A：IL-9表達(dá)與Aml患者預(yù)后的關(guān)系；B：STAT3表達(dá)與Aml患者預(yù)后的關(guān)系；C：miR-21表達(dá)與Aml患者預(yù)后的關(guān)系

圖3 IL-9、STAT3、miR-21以及聯(lián)合診斷ALM的ROC曲線分析

IL-9主要是由Th細(xì)胞產(chǎn)生，作用與多種炎癥細(xì)胞和組織細(xì)胞。T細(xì)胞分泌的IL-9還可介導(dǎo)肥大細(xì)胞募集，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡等，參與腫瘤免疫[5,6]。有研究顯示，IL-9在惡性腫瘤疾病中過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤增殖，進(jìn)而可降低化療藥物敏感性[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清IL-9表達(dá)水平較健康人群明顯升高，可為臨床干預(yù)提供一定參考價(jià)值[9]。楊慧等[10]研究顯示，Aml患者外周血T細(xì)胞中IL-9 mRNA表達(dá)顯著高于健康對(duì)照者，且初診M2、M3及復(fù)發(fā)M2組IL-9 mRNA表達(dá)高于緩解狀態(tài)下M2和M3患者，推測(cè)IL-9促進(jìn)Aml增殖可能是利用自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，Aml患者的PBMC中IL-9 mRNA和蛋白也均過(guò)表達(dá)，與患者FBA分型、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞關(guān)系密切，其低表達(dá)患者生存期顯著高于高表達(dá)患者，提示IL-9可能參與該疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。利用相關(guān)抗體阻斷IL-9或去除IL-9相關(guān)基因的表達(dá)，可能會(huì)減慢Aml疾病的發(fā)展進(jìn)程，提高機(jī)體的抗腫瘤作用。

IL-9及其受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要依賴于Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer and activators of transcription，STAT)信號(hào)通路[11]。STAT3作為近年來(lái)研究重點(diǎn)，其可介導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，當(dāng)過(guò)度激活后將致細(xì)胞發(fā)生異常增殖，或影響細(xì)胞自身凋亡，使凋亡受阻，在腫瘤發(fā)展進(jìn)程中起重要作用，因此STAT3也被公認(rèn)為一種癌基因[12]。湯穎俊等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，Aml細(xì)胞內(nèi)的p-STAT3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并增加Aml細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，加入STAT3抑制劑后，其表達(dá)水平下降，STAT3的靶向治療為該疾病的治療提供新思路。覃沁怡等[14]研究發(fā)現(xiàn)，IL-9可能通過(guò)激活STAT3磷酸化達(dá)到促人胰腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用。本研究結(jié)果顯示，Aml患者PBMCs中STAT3 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)，磷酸化STAT3蛋白表達(dá)也顯著增加，其高表達(dá)患者生存期低于低表達(dá)患者，提示STAT3在Aml患者PBMCs中表達(dá)異常，參與Aml疾病的發(fā)展過(guò)程，與患者預(yù)后不良相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-9與STAT3表達(dá)呈正相關(guān)，IL-9可能通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

生物信息學(xué)研究顯示，miR-21基因啟動(dòng)子區(qū)域有STAT3的結(jié)合位點(diǎn)，可調(diào)控miR-21表達(dá)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是典型的致癌性microRNA。目前，已發(fā)現(xiàn)miR-21在宮頸癌、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)[16-18]，且與疾病的發(fā)展進(jìn)程和患者預(yù)后相關(guān)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)miR-21在慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤中也過(guò)表達(dá)。黃婷等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Aml患者骨髓細(xì)胞中miR-21表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，在白血病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，有望成為白血病診斷的新的分子標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示，Aml患者PBMCs中miR-21mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，高表達(dá)患者生存期較低表達(dá)患者顯著降低，提示miR-21在Aml疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，其高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可能調(diào)控STAT3信號(hào)通路達(dá)到抑制腫瘤凋亡，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[20]。本研究結(jié)果顯示，IL-9、STAT3和miR-21表達(dá)兩兩正相關(guān)，三者聯(lián)合可提高Aml診斷的靈敏度、特異度以及ROC曲線下面積，推測(cè)IL-9可能也是通過(guò)STAT3信號(hào)通路上調(diào)miR-21表達(dá)，聯(lián)合檢測(cè)三者表達(dá)對(duì)Aml具有一定的診斷價(jià)值。

綜上所述，Aml患者PBMCs中IL-9、STAT3和miR-21均表達(dá)異常，與疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程及預(yù)后相關(guān)，對(duì)Aml診斷具有一定價(jià)值，可作為該疾病診斷和預(yù)后的參考指標(biāo)。深入研究IL-9、STAT3和miR-21在該疾病中的作用機(jī)制，可能為其治療提供新的靶點(diǎn)。