高錯誤率長序列的高敏感度比對

羅賢橦，鐘 誠，黎 瑤

(廣西大學 計算機與電子信息學院 廣西高校并行分布式計算技術重點實驗室，南寧 530004)

1 引 言

以單分子實時測序技術(SMRT)[1]和Oxford Nanopore技術(ONT)[2]為代表的第三代測序平臺(Third Generation Sequencing，TGS)極大地降低了測序的成本[3]，可以解決人類基因組中具有復雜區(qū)域的測序問題[4].另一方面，第三代測序平臺產(chǎn)生錯誤率超過15%、長度超過10k bp的長序列.測序序列長度的增加，使得一個長序列中可能包含一個完整的結構變異區(qū)域，序列比對問題從僅需要處理較短長度的錯誤(例如SNP錯誤和較短的“indel”錯誤)，演變到需要處理較長的結構變異(轉置、易位、重復和長度超過50bp的“indel”)錯誤，從而增加了序列比對的難度，降低了序列比對的敏感度.

針對這類錯誤率較高且包含錯誤類型較復雜的長序列比對方法有BWA-MEM[5]、BLASR[6]、Kart[7]、YAHA[8]、LAMSA[9]、Minimap2[10]和LordFAST[11]等.以BWA-MEM[5]、Kart[7]和Minimap2[10]為代表的長序列比對算法使用了雙端映射(paired-end mapping，PEM)的方法，它依賴于精確匹配將種子定位到結構變異錯誤的任意一側，且將種子擴展到序列全部堿基.第三代測序數(shù)據(jù)中的高錯誤率會導致比對算法難以找到長度較長的精確匹配，且序列長度的增長將會導致產(chǎn)生許多假陽性的較短的精確匹配結果，這將影響種子搜索的效率以及長序列比對的敏感度和查全率.隨著第三代測序技術的發(fā)展和序列組裝算法的改進[12]，分割序列映射(split-read mapping，SRM)[8]成為長序列比對的一種有效策略.它更易于發(fā)現(xiàn)序列中的結構變異錯誤，且可在比對過程中減少結構變異錯誤對比對結果的影響.比對方法STAR[13]、YAHA[8]、LAMSA[9]、LordFAST[11]采用了該種策略.其思想是：首先將長序列分割成等長的若干片段，并將片段映射到參考基因組，生成片段定位的侯選位置，然后以片段侯選位置為依據(jù)，根據(jù)片段間可能存在的“錯誤”關系將片段侯選位置依次連接起來，從而獲得長序列的比對結果.其中片段定位的過程將片段與參考基因比對，生成一組滿足給定編輯距離的片段侯選位置.這些比對算法在處理高錯誤率的長序列比對時，查全率有所降低，且對錯誤率高的真實數(shù)據(jù)集比對的敏感度較低.

為解決現(xiàn)有序列比對算法對長度更長、錯誤率更高的第三代測序數(shù)據(jù)比對敏感度不夠高的問題，本文研究使用對高編輯距離閾值更敏感的基于Hash索引的變長種子擴展方法，通過在種子驗證階段特殊處理新型錯誤“均聚物”[14]，以提高算法對第三代測序長序列比對的查全率，在連接序列片段前，加入對片段侯選位置的質(zhì)量評估，以過濾質(zhì)量不高的侯選位置、提高連接效率，且在連接片段候選位置時，對不同錯誤類型賦予不同罰分，計算比對相似度，以減少假陽性的結果，獲得高準確度和提高敏感度.

2 方 法

將高錯誤率長序列與參考基因組進行比對的第一步是將每條長序列劃分為若干較短的片段.第二步以基于Hash索引的變長種子擴展算法定位序列片段在參考基因組中的候選位置，在種子驗證過程中將連續(xù)“插入刪除”相同堿基錯誤所帶來的編輯距離設置為1，使種子擴展算法可以有效處理第三代測序長序列中的新類型錯誤“均聚物”[14]，以使得片段定位時可提升查全率；采用全映射比對思想，尋找所有滿足編輯距離閾值的片段侯選位置.第三步連接序列片段的侯選位置，對片段侯選位置進行評分，以去除質(zhì)量不高的侯選位置，然后將片段連接以構建長序列比對結果的基本骨架.第四步，補全片段間的空隙，在補全過程中引入Z-drop[5]方法，以避免連接兩條不相關的片段而帶來的假陽性結果.本文給出的基于分割-全映射-篩選-連接-補全的高錯誤率長序列比對方法的執(zhí)行過程如圖1所示.

下面詳細地闡述基于分割-全映射-篩選-連接-補全的高錯誤率長序列比對方法.

2.1 片段定位

已有的種子擴展方法被設計用于長度較短且錯誤率較低的短序列比對(short-read alignment)[15].這類種子擴展方法一般采用BWT索引結構[16]或FM索引結構[17]儲存參考基因組序列信息，這兩種索引結構沒有存儲全部的序列信息.因此，對于高編輯距離閾值的比對敏感度較低.為了提升對高編輯距離閾值的序列比對的敏感度，本文采用對編輯距離閾值更加敏感的Hash索引結構[18]，通過儲存參考基因組的k階子串k-mers出現(xiàn)的所有位置，來實現(xiàn)快速搜索大量的序列[22].與BWT[16]、FM-index[17]等索引機制相比，Hash索引對高編輯距離閾值和長度更長的序列比對具有更高的敏感度，可以找到更多的符合閾值的比對結果.但隨著編輯距離閾值的增大，會出現(xiàn)更多的假陽性的侯選位置，此外，Hash索引結構的不足是難以處理序列中存在的“插入刪除(indel)”錯誤.為解決上述問題，本文采用變長種子選擇算法[19,20]處理“插入刪除(indel)”錯誤，且在種子驗證過程中，將連續(xù)“插入刪除”多個相同堿基的錯誤的編輯距離設置為1，以使得在種子擴展時可以處理第三代測序長序列存在的新型“均聚物”錯誤[14]，同時采用附加k-mer算法[21]去除可能產(chǎn)生的假陽性錯誤.

圖1 基于分割-全映射-篩選-連接-補全的高錯誤率長序列比對過程Fig.1 Process of aligning long reads with high error rate based on split-all mapping-filter-linking-completion

2.1.1 變長種子生成

與第二代測序數(shù)據(jù)主要存在“替換”錯誤相比，第三代測序數(shù)據(jù)中存在的錯誤類型還有“插入刪除”錯誤，以往使用漢明距離確定種子候選位置的方式，并不適用于第三代測序數(shù)據(jù).為使得比對算法既支持處理“替換”錯誤，又支持處理“插入刪除”錯誤，本文采用可以處理“插入刪除”錯誤的變長種子篩選方法[19,20]，并執(zhí)行附加k-mer算法[21]以去除假陽性的侯選位置.

設測序序列片段和參考基因組之間允許的編輯距離為e，根據(jù)鴿巢原理[5]，則至少選取序列片段的e+1個非重疊的k-mers，才能確保至少有一個k-mer與參考基因組的精確匹配是正確的.因此，通過將一組e+1個不重疊的固定長度的k-mer與參考基因組比對，即可獲得一組侯選位置集合Seed.為了使得算法可以處理“插入刪除”錯誤，采用充分利用不重疊的k-mer之間堿基的變長種子算法，通過將固定長度k-mer進行擴展，獲得一組新的變長種子侯選位置集合BSeed.在擴展時為了提高侯選位置驗證階段的效率，優(yōu)先擴展出現(xiàn)頻率較高的k-mer，以降低變長種子候選集BSeed中候選位置的數(shù)量.經(jīng)過這樣處理，可以最大程度地利用待比對片段上的所有堿基進行種子的生成，使得算法可以處理“插入刪除”錯誤，提高片段比對的準確度.圖2展示了一組3-mer的變長種子的生成過程實例，其中圖2(a)展示找到一組不重疊的固定長度的k-mer與參考基因組進行精確匹配所獲得的一組侯選位置，其中3-mer GGG在參考基因組中有5個侯選位置.圖2(b)展示對固定長度的k-mer進行擴展，通過將3-mer GGG擴展為GAGGG，得到長度為5的精確匹配，獲得一組假陽性較少的侯選位置.

圖2 變長種子生成過程實例Fig.2 Example of generating variable-length seeds

同時，為增加種子定位的準確度，采用附加k-mer的方法[21]，將選取比對片段的e+2個非重疊的k-mers，作為一組候選種子，以確保其中至少有2個k-mer與參考基因組的精確匹配是正確的，進一步減少假陽性的種子侯選位置.

2.1.2 種子驗證

在確定候選位置之后，對種子候選位置進行驗證，僅保留所有滿足編輯距離閾值小于等于e的侯選位置，作為最終的片段位置.第三代測序平臺產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)中可能含有新型的 “均聚物”錯誤[16]，即出現(xiàn)連續(xù)“插入或刪除多個相同堿基”的錯誤.當遇到這種錯誤時，驗證操作會將原本定位正確的種子過濾掉，從而降低比對的查全率.針對這種新類型的錯誤，本文方法在驗證種子時，將“連續(xù)插入或刪除同一個堿基的錯誤”作為一個編輯錯誤處理，即在驗證種子階段，當發(fā)現(xiàn)連續(xù)出現(xiàn)相同堿基的“插入/刪除“錯誤時，則將其編輯距離定義為1，即將該種錯誤所造成的不匹配作為1個編輯操作，以增加片段定位的查全率，從而提升長序列比對的敏感度.

2.2 骨架構建

2.2.1 篩選片段侯選

在種子定位過程中，通過增大編輯距離來增加序列片段的比對侯選位置數(shù)量，這將導致假陽性侯選位置增多.因此，在骨架構建之前，對片段侯選位置進行篩選，以去除質(zhì)量不高的序列片段比對的結果.

對于含有許多重復的相同堿基的序列片段，將其定位到同樣具有大量重復相同堿基的參考基因組(例如人類基因組)位置上，會導致將片段定位到參考基因組中多個基因的多個不同位置上.這種片段定位得到的比對結果質(zhì)量不高，會造成最終比對的假陽性結果的上升，從而影響最終比對準確度.通過統(tǒng)計長序列分割出的片段侯選位置，可以計算得到片段Pi的比對質(zhì)量：

(1)

其中sumi為片段Pi的全部比對結果數(shù)量，sij為片段Pi在參考基因組中第j條參考基因上的比對結果數(shù)量.當Qi小于給定閾值時，舍棄該片段在第j條參考基因的比對結果.

2.2.2 片段連接

根據(jù)片段間的相互關系，將篩選后的片段進行連接，以進一步減少片段定位候選區(qū)域中的假陽性區(qū)域.從序列P0開始依次將片段的侯選位置Mi與其之前所有已連接的片段相連接,選取其中連接得分最高的連接結果，作為Mi的連接得分f(i)，直至所有侯選位置均被連接到至少一條骨架上為止.本文改進后的連接得分f(i)的計算公式如下：

(2)

其中scorei為片段的侯選位置Mi與參考基因組的匹配得分，f(j)是片段Pj之前的j-1條片段的候選位置的連接得分，a(j,i)是片段Pi與它相連的片段Pj之間的關系罰分.測序序列共存在4種錯誤情況(如圖3所示)：

4)當Mi與Mj在參考基因組上的匹配方向相反時，片段Mi與Mj之間存在轉置錯誤；其中ε是用于計算“插入刪除”錯誤長度的參數(shù),τ,θ是用于計算給定“復制”結構變異錯誤長度的參數(shù)[9].

圖3 測序序列的4種錯誤類型Fig.3 Four error types of sequencing sequences

將所有測序序列片段侯選位置連接生成一個有向無環(huán)圖(DAG)，從圖的起點到終點的一條路徑，即為一條長序列比對的連接結果，將生成的所有連接的得分進行排序，找到連接得分較大排序在前面的那些連接結果.

2.3 空隙填補

當片段連接完成后，對每條長序列的前幾個連接結果執(zhí)行最終比對.為了完成候選區(qū)域的堿基到堿基的對準，它以連接得分從高到低將連接好的片段之間的空隙進行匹配，匹配過程使用動態(tài)規(guī)劃全局比對方法[23]，將序列片段間的堿基一一對應到參考基因組侯選位置上.設定閾值，當兩個片段對準得分(匹配為0，不匹配為-1)超過閾值時，則認為該條連接結果無效，這樣減少將兩個不相關的片段連接到一起而得到假陽性的連接結果.

長序列比對算法主要由兩大部分工作組成，第一部分工作為分割序列及片段定位，通過將長序列分割為若干片段，以更快地得到較短的精確匹配的種子，對種子進行驗證，得到所有滿足編輯距離閾值的片段侯選位置.第二部分工作首先通過片段質(zhì)量評分，去除質(zhì)量不高的片段候選位置，通過片段間的連接關系去除假陽性片段侯選位置，以確保比對結果的準確度.詳細比對過程如算法1所示.

算法1.基于分割-全映射-過濾-連接-補全的比對算法

輸入：編輯距離閾值e，測序序列ri,i=0,1,…,rnum

輸出：序列ri比對結果Si,i=,1,…,rnum

1.Begin

2.fori=1 tornumdo

3. 將序列ri以固定間距l(xiāng)en分割為n個片段P1,…,Pn;

4.forj=1tondo

//找到所有滿足編輯距離閾值e的片段候選位置選擇

//Pj的e+2個非重疊k-mer作為變長種子侯選集Seed；

5.Seed[1].start←1;//種子的起始位置

6.Seed[e].end←|Pj|-1;//種子的結束位置

7.fork=1toe+2do

//將e+2個種子中出現(xiàn)最多的種子擴展，f為種子出現(xiàn)數(shù)

8.ifSeed[k].f>=Seed[k-1].fthen

9.Seed[k].start←Seed[k-1].end+1;

10.else

11.Seed[k-1].end←Seed[k].start-1;

12.endif

13.endfor

14.BSeed←Seed[1:e+2];

//將擴展后的種子Seed[1..e+1]作為新侯選集BSeed

//在Hash索引中搜索BSeed中所有種子的位置，將其存

//入片段侯選位置List[1..num]中

15.forl=1tonumdo

//驗證侯選位置，篩選出符合編輯距離e的侯選位置

16.edit←0；

17.forp=1tolendo//驗證

18.if片段中第p位堿基與參考基因中List[l]+p和List[l]+p-1位堿基均不同then

19.edit←edit+1；

20.endif

21.endfor

22.endfor

23. Ifedit<=ethen//編輯距離小于閾值

24.scorei←|Pj|-edit;

26.endif

27.endfor

28.fork=1 tondo

//統(tǒng)計Pk在參考基因j上的候選位置數(shù)量sij

29.sumk←0;//篩選過程sumk為片段候選結果

30.forj=1 to mdo

31.sumk←sk+sij;

32.endfor

33.ifskj/sumk

34. 舍棄Pk中所有在參考基因j上的比對結果

35.endif

36.endfor

37.forl=1 tomdo

//遍歷所有片段，連接侯選位置Mi生成無環(huán)圖

//計算候選位置Ml的最佳連接得分

39.endfor

40.根據(jù)連接得分將ri的所有連接結果進行排序；

41.選擇得分最高的前幾個連接結果進行片段間的空隙填補，計算序 列ri與參考基因組的匹配得分；

42.將填補后的序列匹配得分排序；

43.將最高匹配得分的結果序列在參考基因組上的起始位置，作為序 列ri最終的比對結果集合S；

44.endfor

45.end

與同類的序列比對算法LAMSA[9]和LordFAST[11]相比,本文算法采用對高編輯距離更敏感的Hash索引結構存儲參考基因組，在定位序列分割片段時，通過變長種子算法[13]使得基于Hash索引的種子擴展可以處理“插入刪除(indel)”錯誤的編輯距離，且將“連續(xù)插入/刪除多個相同堿基”錯誤作為1個編輯距離，處理第三代測序序列特有的新型“均聚物”錯誤，以獲得更全的片段侯選位置，確保片段定位的查全率，根據(jù)片段間的關系過濾掉片段定位侯選位置中的假陽性結果，在確保比對準確度的同時，提升查全率和敏感度.

3 實 驗

實驗使用的計算機為4核Intel(r)Xeon CPU E5-2600 V2處理器、內(nèi)存容量128GB.運行操作系統(tǒng)Ubuntu 16.04.采用C語言編程實現(xiàn)算法.通過網(wǎng)站NCBI(1)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/home/download/下載了公共的人類基因組數(shù)據(jù)集hg19進行比對實驗.

3.1 模擬數(shù)據(jù)實驗

模擬實驗數(shù)據(jù)采用Wgsim(2)https://github.com/lh3/wgsim以人類基因組hg19作為參考基因組生成錯誤率分別為5%和10%的模擬序列數(shù)據(jù)，采用PBsim[23]以hg19作為參考基因組生成錯誤率分別為15%、20%和25%的含有“插入刪除”和結構變異錯誤的長度大于等于5000bp的模擬序列.

對于生成的每條模擬序列，Wgsim和PBsim[23]都提供了模擬序列在參考基因組上的映射位置.一個模擬序列在參考基因組上的“真正”映射位置是已知的，當比對序列得出的比對位置與其模擬映射位置差值在30bp以內(nèi)，則認定為該序列被比對到參考基因組中正確的位置上[7].

序列比對準確度precision和查全率recall的計算[24]：

(3)

(4)

其中TP為正確映射到參考基因上的序列數(shù)量,RN為被映射到參考基因組的序列數(shù)量，N為參加映射比對的序列數(shù)量.

在模擬數(shù)據(jù)上的實驗主要是為了評估序列比對算法的準確度和查全率.隨著測序序列錯誤率的上升，比對算法采用的編輯距離也需隨之增加，以獲得更多的侯選位置.為此，首先對不同錯誤率下編輯距離閾值的選擇進行實驗：對10000條長度為5000bp的錯誤率分別為5%、10%、15%、20%和25%的模擬序列數(shù)據(jù)進行實驗，測試不同的編輯距離閾值對算法的比對準確度和查全率的影響.錯誤率低于15%的模擬序列屬于低錯誤率數(shù)據(jù)，選取編輯距離閾值小于5進行實驗，結果如表1所示.而錯誤率大于等于15%的模擬序列屬于高錯誤率數(shù)據(jù)，需要更高的編輯距離閾值，選取編輯距離閾值為5、10和15進行對比試驗，結果如表2所示.

表1和表2的實驗結果表明，測序序列的錯誤率越高，片段中所含的錯誤個數(shù)也就越多.此時，如果不提高編輯距離的閾值，那么將會導致丟失許多的真陽性位置，從而導致比對準確度和查全率的下降.當測序序列中錯誤率小于15%時，比對準確度變化不大，考慮算法處理時間，編輯距離閾值選擇2即可.當錯誤率大于等于15%時，編輯距離閾值應選擇15以獲得更高的比對準確度和查全率.

表1 不同編輯距離閾值、低錯誤率模擬長序列比對的準確度與查全率Table 1 Accuracy and recall of simulated long-read alignment with different edit distance threshold and low error rate

表2 不同編輯距離閾值、高錯誤率模擬長序列比對的準確度與查全率Table 2 Accuracy and recall of simulated long-read alignment for different edit distance threshold and high error rate

下面，通過對模擬序列數(shù)據(jù)進行兩組實驗以評估不同序列比對算法的性能.

第一組比對實驗：對長度相同、錯誤率不同的模擬測序序列進行實驗，測試了LAMSA、LordFAST和本文算法HSSM的比對準確度和查全率.LAMSA和LordFAST算法中閾值參數(shù)選擇其論文中的給定值(錯誤率小于15%時,容忍錯誤率為4%，錯誤率大于等于15%，容忍錯誤率30%)，本文算法HSSM對于錯誤率分別為5%和10%的序列比對編輯距離閾值取值為2，對于錯誤率分別為15%、20%和25%的序列比對編輯距離閾值取值為15.實驗結果如表3所示.

表3 不同錯誤率下算法比對10000條長度為5000bp的序列準確度和查全率Table 3 Accuracy and recall rate of aligning 10,000 longreads with length of 5000bp for different error rates

表3結果表明，算法HSSM采用了對高編輯距離閾值更加敏感的Hash索引方式，且在片段定位過程中針對第三代測序序列中的新錯誤類型“均聚物”進行處理，將所有滿足編輯距離閾值的片段比對結果作為片段連接時的侯選位置，整體上獲得更高的比對準確度，且獲得了更多的片段候選位置，提升了定位片段的查全率，從而使得最終比對結果的查全率也隨之提高.

第2組比對實驗選取錯誤率分別為5%、10%、15%、20%和25%的10000條序列.對于錯誤率為5%和10%的情形，選取長度分別為1000bp、2000bp、5000bp和10000bp的4組模擬序列進行實驗，實驗結果見表4和表5.對于錯誤率為15%、20%和25%的情形，由于是模擬第三代測序的長序列數(shù)據(jù)，所以選取長度為5000bp和10000bp的模擬長序列進行對比，結果如表6、表7和表8所示.

從表4-表8的結果看，與LAMSA和LordFAST算法相比，在錯誤率相同且錯誤率較低的情形下，總體而言，本文算法HSSM的準確度和查全率有所提升.隨著錯誤率的升高，HSSM算法獲得的比對查全率高于其他兩種算法.這是由于本文算法HSSM采用了基于Hash索引結構的變長種子算法，更加適應高編輯距離閾值的序列比對，可以獲得更多的侯選位置，提升了片段定位的查全率，進而提升了長序列比對的查全率，且通過侯選位置的篩選和片段間可能存在的錯誤關系的罰分，有效去除部分假陽性錯誤的結果，使得長序列比對保持高的準確度.另一方面，隨著模擬序列長度的增長，將長序列分割成了更多的片段，獲得了更多的侯選位置，可以有效地根據(jù)片段侯選位置之間的位置關系，去除錯誤的比對結果，使得算法準確度隨著測序序列長度的上升而提高.

表4 錯誤率為5%的10000條序列比對的準確度和查全率Table 4 Accuracy and recall of aligning 10,000 long readswith error rate 5%

表5 錯誤率為10%的10000條序列比對的準確度和查全率Table 5 Accuracy and recall of aligning 10,000 long readswith error rate 10%

表6 錯誤率為15%的10000條長序列比對準確度和查全率Table 6 Accuracy and recall of aligning 10,000 long readswith error rate 15%

表7 錯誤率為20%的10000條長序列比對準確度和查全率Table 7 Accuracy and recall of aligning 10,000 long readswith error rate 20%

表8 錯誤率為25%的10000條長序列比對準確度和查全率Table 8 Accuracy and recall of aligning 10,000 long readswith error rate 25%

3.2 真實數(shù)據(jù)上的實驗

對于真實數(shù)據(jù)集上的實驗，采用比對敏感度sensitivity來評估序列比對算法[24]：

(5)

其中N為匹配對準的序列條數(shù)，RN為測序數(shù)據(jù)集的序列總數(shù).

采用PacBio測序平臺產(chǎn)生的M130929數(shù)據(jù)集中的幾組真實數(shù)據(jù)進行測試實驗，結果如表9所示.

表9 真實數(shù)據(jù)集上算法的比對敏感度(%)Table 9 Sensitivity (%)of alignment algorithms on real dataset

表9的結果表明，算法HSSM使用了對高錯誤率更加敏感的基于hash索引結構的變長種子算法，使得hash索引可以處理“插入/刪除”的錯誤類型，并針對第三代測序序列中新出現(xiàn)的“均聚物”錯誤類型設定其編輯距離為1進行比對，獲得了更多片段候選區(qū)域，從而獲得更多的比對結果，且通過采用附加k-mer算法減少了產(chǎn)生假陽性的比對結果，進而獲得更高的比對敏感度.

綜合在模擬和真實序列數(shù)據(jù)上的實驗結果表明，本文算法HSSM針對第三代測序數(shù)據(jù)的特點設計改進，在獲得更多侯選位置的同時，去除了假陽性的比對結果，既確保獲得高的比對準確度，又獲得了更高的查全率和敏感度.

4 總 結

通過基于Hash索引結構的變長種子算法，采用全映射思想定位長序列分割出的序列片段，可以最大程度地確保分割出的序列片段比對的查全率.分割映射的序列比對方法可以更好地處理第三代測序數(shù)據(jù)中的結構變異帶來的“插入/刪除”和“均聚物”錯誤,且通過篩選和動態(tài)連接片段侯選位置，可以得到更高的比對準確率和敏感度.高錯誤率的長序列比對算法中，編輯距離閾值的提高會增加種子候選數(shù)量，且隨著第三代測序序列的長度越來越長，也會導致種子候選位置增加，從而使得種子驗證成本增加，算法的時間開銷也隨之上升.第三代測序數(shù)據(jù)的高錯誤率的長序列比對是一個計算復雜問題.下一步工作將在借鑒全映射比對并行算法[25]的基礎上，研究設計求解高錯誤率長序列比對問題的CPU/GPU混合并行算法，以確保比對準確度、查全率和敏感度的同時，顯著加速比對完成.