麻黃附子細(xì)辛湯對(duì)局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥模型大鼠血尿生化及腎臟病理的影響

蘇哲苓 盧 嫣 韓世盛 姚天文 王 怡

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腎內(nèi)科，上海200437）

局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥（FSGS）是慢性腎炎中一種常見(jiàn)的病理類型，西醫(yī)常用激素和免疫抑制劑治療，但往往療效欠佳且副作用較大。臨床上常使用麻黃附子細(xì)辛湯治療腎臟病[1-6]，但未見(jiàn)運(yùn)用本方治療FSGS的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以FSGS模型大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察麻黃附子細(xì)辛湯對(duì)FSGS模型大鼠血、尿生化指標(biāo)及腎臟病理的影響，為麻黃附子細(xì)辛湯治療FSGS的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)5周齡雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（146±5）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2013-0109。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)：16695。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物與試劑 中藥顆粒劑麻黃附子細(xì)辛湯（生麻黃6 g，制黑附子9 g，細(xì)辛3 g），江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：16101151。尿蛋白測(cè)定試劑盒，上海執(zhí)誠(chéng)生物科技有限公司，批號(hào)：ZCOCTR011、ZCNOVR007、ZCFEBR028；血生化試劑盒，上?？迫A卓越生物工程股份有限公司，批號(hào)：2016061K；Masson染色液，北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DC0032；嘌呤霉素氨基核苷（PAN）試劑，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：113M4100V、045M4068V。

1.3 主要儀器 全自動(dòng)生化儀（型號(hào)：450），上?？迫A卓越生物工程股份有限公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：CX41），日本Olympus株式會(huì)社；透射電鏡（型號(hào)：Tecnai G2 spirit），美國(guó)FEI公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組 24只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組與治療組，每組8只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周左右開(kāi)始造模。

2.2 造模與干預(yù) 根據(jù)中日友好醫(yī)院2005年發(fā)表的嘌呤霉素氨基核苷（PAN）腎病模型造模方法，結(jié)合課題組前期成功造模方法進(jìn)行造模[7]。具體方法如下：首劑靜脈注射PAN 90 mg/kg，在蛋白尿達(dá)到高峰后（約第13天）分別于第14、17、20、23、26天追加PAN 9 mg/kg，造模周期為56 d（8周）。

藥物干預(yù)與造模同步。大鼠藥物劑量根據(jù)《心血管病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[8]推薦劑量結(jié)合本實(shí)驗(yàn)?zāi)I毒性研究需要，人鼠劑量換算按每公斤體重計(jì)算為成人劑量的20倍。成人的麻黃、附子、細(xì)辛劑量按照鄧中甲主編的2008版《方劑學(xué)》中麻黃附子細(xì)辛湯劑量：生麻黃6 g，制黑附子9 g，細(xì)辛3 g。制備麻黃附子細(xì)辛湯水溶液，每毫升含生藥0.6 g。治療組大鼠每日1次灌胃給藥，灌胃劑量為每100 g體質(zhì)量1 mL，正常組和模型組灌胃等量蒸餾水，均連續(xù)灌胃56 d。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 24 h尿蛋白定量 應(yīng)用基礎(chǔ)代謝籠收集造模第0、2、4、8周時(shí)各組大鼠24 h尿液，采用免疫比濁法檢測(cè)尿蛋白。

2.3.2 血生化指標(biāo) 造模第56天，各組大鼠用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后，無(wú)菌下打開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈采血，處死，留取腎臟標(biāo)本。采用溴甲酚綠法檢測(cè)血漿白蛋白，采用紫外-谷氨酸脫酶法檢測(cè)血尿素氮，采用肌氨酸氧化酶法檢測(cè)血肌酐，采用氧化酶法檢測(cè)血尿酸，采用甘油磷酸氧化酶法檢測(cè)血甘油三酯，采用氧化酶法檢測(cè)血總膽固醇。

2.3.3 腎小球硬化指數(shù)及腎小管間質(zhì)病變程度 留取大鼠腎臟皮質(zhì)組織，經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖液固定后，石蠟包埋，切片厚約3 μm，行Masson染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。

采用一種半定量指標(biāo)，即通過(guò)計(jì)算腎小球硬化指數(shù)（GSI）來(lái)判斷腎小球的硬化程度。GSI計(jì)算公式為：GSI=[（1×n1+2×n2+3×n3+4×n4）/每片腎小球總數(shù)]×100%（n1～n4分別代表1級(jí)～4級(jí)損害腎小球個(gè)數(shù)）。在各腎組織切片中隨機(jī)檢測(cè)50個(gè)腎小球，將每個(gè)腎小球損害程度分為0～4級(jí)，0級(jí)表示腎小球無(wú)病變，1級(jí)表示1個(gè)腎小球的硬化區(qū)域?yàn)?%～25%，2級(jí)表示1個(gè)腎小球的硬化區(qū)域?yàn)?6%～50%，3級(jí)表示1個(gè)腎小球的硬化區(qū)域?yàn)?1%～75%，4級(jí)表示1個(gè)腎小球的硬化區(qū)域?yàn)?6%～100%。

腎小管間質(zhì)評(píng)分：根據(jù)光鏡明確腎小管和腎間質(zhì)病變程度（每張切片腎小球＞10個(gè)），腎小管急性病變以上皮細(xì)胞變性、壞死、細(xì)胞脫落作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，腎小管和腎間質(zhì)慢性病變以腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化的面積作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行半定量分析。全部腎活檢組織內(nèi)病變面積＜25%為0分，≥25%、＜50%為1分，≥50%、＜75%為2分，≥75%為3分。

表2 各組大鼠干預(yù)后血生化指標(biāo)比較

表1 各組大鼠各時(shí)期24 h尿蛋白定量比較（±s） 單位：mg

表1 各組大鼠各時(shí)期24 h尿蛋白定量比較（±s） 單位：mg

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組同時(shí)期比較，#P＜0.05；與本組造模第0周比較，△△P＜0.01。

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2.3.4 足突超微結(jié)構(gòu) 采用透射電鏡觀察足突超微結(jié)構(gòu)。選取約1 mm×1 mm大鼠腎臟皮質(zhì)組織塊，2.5%戊二醛4 ℃固定，1%四氧化鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹(shù)脂與丙酮包埋，聚合成塊，超薄切片（50～70 nm）后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察、攝片。計(jì)算足突融合率：首先測(cè)量基底膜總長(zhǎng)度，設(shè)為A，然后測(cè)量基底膜足突融合的總長(zhǎng)度，設(shè)為B，A/B的百分率即為足突融合率。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)。非重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料，若符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；若不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn)。重復(fù)測(cè)量的計(jì)量資料，若符合正態(tài)分布，用重復(fù)測(cè)量方差分析；若不符合正態(tài)分布，將原始變量轉(zhuǎn)換為秩次后，用秩次變量作重復(fù)變量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠各時(shí)期24 h尿蛋白定量比較 實(shí)驗(yàn)前（造模第0周）各組大鼠24 h尿蛋白定量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模各時(shí)期組內(nèi)及組間比較見(jiàn)表1。

3.2 各組大鼠干預(yù)后血生化指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。

3.3 各組大鼠腎臟組織病理變化

3.3.1 光鏡下各組大鼠腎小球、系膜區(qū)、腎小管間質(zhì)病理情況比較 正常組：腎小球毛細(xì)血管襻開(kāi)放良好，系膜細(xì)胞與系膜基質(zhì)未見(jiàn)增生，基底膜無(wú)增厚；腎小管及間質(zhì)無(wú)明顯病理改變。模型組：腎小球光鏡下出現(xiàn)節(jié)段硬化或球囊粘連，節(jié)段性毛細(xì)血管閉塞或血管外泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)，系膜區(qū)未見(jiàn)明顯增生；腎小管上皮細(xì)胞扁平甚至脫落；腎間質(zhì)膠原纖維增生。治療組：病理變化與模型組相似，但病變程度有所減輕。見(jiàn)圖1。

3.3.2 電鏡下各組大鼠腎小球足細(xì)胞變化比較 正常組：腎小球足細(xì)胞足突排列規(guī)整。模型組：腎小球足細(xì)胞足突融合，裂孔間隙消失，可見(jiàn)基底膜裸露，可見(jiàn)凋亡足細(xì)胞、空泡樣變性足細(xì)胞。治療組：病理變化與模型組相似，但病變程度有所減輕。見(jiàn)圖2。

3.3.3 各組大鼠腎小球硬化指數(shù)、腎小管間質(zhì)評(píng)分和足突融合率比較 見(jiàn)表3。

4 討論

4.1 局灶節(jié)段硬化性腎病大鼠模型 模型組大鼠24 h尿蛋白水平較正常組明顯升高，并且在第2周達(dá)到高峰，后期蛋白尿逐漸減少，可能與腎入球動(dòng)脈硬化、腎小管萎縮、腎小球纖維化，導(dǎo)致蛋白尿、血肌酐等體內(nèi)的代謝物較難排出體外有關(guān)。模型組大鼠血白蛋白下降、腎功能和血脂指標(biāo)明顯上升，且腎小球光鏡下出現(xiàn)明顯節(jié)段硬化，腎小管上皮細(xì)胞扁平甚至脫落，腎間質(zhì)膠原纖維增生，電鏡下腎小球足細(xì)胞足突廣泛融合成片狀，可見(jiàn)凋亡足細(xì)胞、空泡樣變性足細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為本研究所使用的造模方法可獲得較好的FSGS模型。

4.2 麻黃附子細(xì)辛湯的干預(yù)效果及意義 本研究結(jié)果顯示，麻黃附子細(xì)辛湯作用于FSGS模型大鼠時(shí)，不但沒(méi)有加劇腎功能損傷，反而使大鼠24 h尿蛋白定量好轉(zhuǎn)，腎小球硬化指數(shù)降低，腎小管間質(zhì)評(píng)分好轉(zhuǎn)，足突融合率減輕，說(shuō)明麻黃附子細(xì)辛湯可有效延緩FSGS進(jìn)展。同時(shí)，本研究亦發(fā)現(xiàn)麻黃附子細(xì)辛湯可改善大鼠因FSGS引起的脂質(zhì)代謝紊亂。藥理學(xué)研究表明麻黃附子細(xì)辛湯具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用，其作用可能與激素相似[9]。本研究對(duì)臨床上麻黃附子細(xì)辛湯用于FSGS及因此引發(fā)的脂質(zhì)代謝紊亂的治療具有重要指導(dǎo)意義。

4.3 “有故無(wú)殞”理論對(duì)中藥毒性研究的指導(dǎo)意義 “有故無(wú)殞”理論始見(jiàn)于《素問(wèn)·六元正紀(jì)大論》，原意為孕婦在患有大積大聚之病時(shí)，只要辨證論治準(zhǔn)確，適度使用性味峻烈的藥物既可祛除疾病，又不會(huì)傷害母體及胎兒，但是用藥要適度。《內(nèi)經(jīng)》“有故無(wú)殞”理論告訴我們，當(dāng)人體有?。础坝泄省保r(shí)，疾病承擔(dān)藥物的治療作用（藥性），不會(huì)損傷人體（即“無(wú)殞”）。麻黃附子細(xì)辛湯中單味藥附子（含烏頭堿）、細(xì)辛（含馬兜鈴酸）的腎毒性研究有較多報(bào)道[10-16]。但是這類藥物的腎毒性研究多以正常生理狀態(tài)動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，忽略了“中藥應(yīng)該在中醫(yī)理論指導(dǎo)下使用”這一基本原則[17]。而且中藥講究的是復(fù)方配伍，方劑配伍是中藥臨床增加療效、減少毒性的重要方法。曹蘭秀等[18]研究發(fā)現(xiàn)附子細(xì)辛配伍，附子可有效降低細(xì)辛的毒性。本研究結(jié)果為“有毒”中藥及“含有毒中藥”的組方在“有故無(wú)殞”理論指導(dǎo)下的臨床安全應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理變化（Masson染色，×200）

圖2 各組大鼠腎臟組織電鏡下足突細(xì)胞變化（醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，×6 000）

表3 各組大鼠干預(yù)后腎小球硬化指數(shù)、腎小管間質(zhì)評(píng)分和足突融合率比較

4.4 辛溫法治療慢性腎炎的探討 辛溫方麻黃附子細(xì)辛湯始見(jiàn)于《傷寒論》。根據(jù)性味及歸經(jīng)，此方具有開(kāi)宣肺氣、通調(diào)水道、調(diào)暢三焦氣機(jī)、祛風(fēng)通絡(luò)、疏通津液、生復(fù)陽(yáng)氣、運(yùn)化濁飲等功效?！瓣?yáng)化氣，陰成形”出自《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》，張景岳注解道：“陽(yáng)動(dòng)而散，故化氣；陰?kù)o而凝，故成形?！?/p>

筆者認(rèn)為，有形之邪，本乃體內(nèi)精微物質(zhì)，因外邪侵襲、脈絡(luò)不通、陽(yáng)氣不運(yùn)，導(dǎo)致原本循經(jīng)運(yùn)行于脈內(nèi)的精微物質(zhì)被迫行于脈外而成有形之邪。對(duì)于慢性腎炎而言，“有形之邪”就是原本的精微物質(zhì)（水液、血液、蛋白等）不能循經(jīng)運(yùn)行于脈內(nèi)，被迫溢于脈外，而成水腫、血尿、蛋白尿、高脂、足突融合等病理產(chǎn)物。此時(shí)可予“辛通溫化法”論治，以達(dá)到“宣散表邪，少火生氣，以氣化形，疏通脈絡(luò)，使?jié)彡幣懦鲶w外，精微物質(zhì)復(fù)循行于脈內(nèi)，輸布潤(rùn)澤全身”的目的，在治療時(shí)需注意中病即止。此觀點(diǎn)也在本實(shí)驗(yàn)中得到了有效論證。

本研究雖然得到預(yù)期效果，但未對(duì)不同劑量的中藥進(jìn)行研究。在今后的課題研究中，我們將設(shè)置小劑量、正常劑量、中毒劑量甚至更多的劑量組，使其更具有說(shuō)服力。