辛伐他汀通過AMPK/mTOR信號通路及氧化應(yīng)激對鼻咽癌細胞凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的作用研究

陳洪昌，廖 蕾，周光耀，張惠琴

（1.成都市新都區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，四川 成都 610500；2.四川大學華西醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科；3.貴州醫(yī)科大學耳鼻喉頭頸外科）

鼻咽癌臨床常見，惡性程度高，治療手段主要為手術(shù)及放化療。但術(shù)后容易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，嚴重威脅病患生命健康。雖然目前有新型化療藥物使用，但臨床實際應(yīng)用效果仍差，尋找有效的抗鼻咽癌藥物，仍是鼻咽癌治療的重要研究方向。

辛伐他?。╯imvastatin，SIM）是一個經(jīng)典的降血脂藥物，近年來，多項研究顯示，辛伐他汀能夠降低病人腫瘤的發(fā)病率，甚至可以提高惡性腫瘤病人的生存率，進而引起研究者們廣泛興趣[1～3]。研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀具有抗腫瘤細胞生物活性，在體內(nèi)外均能抑制腫瘤細胞的生長，并且能夠增強腫瘤放化療的敏感性[4，5]。目前辛伐他汀已被用于多項癌癥病人的臨床治療研究[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能夠抑制鼻咽癌細胞生長及促進凋亡，但是機制不明[5，7]。因此為觀察辛伐他汀對鼻咽癌的抗腫瘤作用，本文的研究對象為人鼻咽癌CNE-2細胞，并通過臨床藥物辛伐他汀作用觀察藥物對鼻咽癌CNE-2細胞的生命周期影響狀況。

AMPK/mTOR信號通路和氧化應(yīng)激在腫瘤生長、代謝、凋亡過程等過程中作用關(guān)鍵，有報道顯示，辛伐他汀通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路、氧化應(yīng)激系統(tǒng)對肺癌、胰腺癌起誘導(dǎo)凋亡的作用。目前辛伐他汀抗腫瘤的研究多見于乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等等，關(guān)于辛伐他汀與鼻咽癌相關(guān)研究較少[8]，本研究進一步觀察了辛伐他汀對鼻咽癌細胞的的作用及其與AMPK/mTOR信號通路和氧化應(yīng)激的關(guān)系，為進一步臨床研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 CNE-2細胞培養(yǎng)及傳代

本文所選用的試驗材料為本單位保存的人鼻咽癌細胞CNE-2，細胞培養(yǎng)液主要組成成分為10%胎牛血清，去定量的人鼻咽癌細胞CNE-2并將其置于37℃，含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，人鼻咽癌細胞CNE-2為單層貼壁生長。隔兩天傳代，試驗中以對數(shù)生長期細胞進行處理。

1.2 主要儀器與試劑

辛伐他汀、DMSO、MTT等試劑和藥物均采購于美國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞檢測試劑盒采購于美國Invitrogen公司，Gallios流式細胞儀，Caspase-3檢測試劑盒則采購于碧云天生物技術(shù)研究所，考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒購于上海美季生物技術(shù)有限公司；SDS-聚丙烯酰胺、PBST溶液、GIS-2020D凝膠圖像分析系統(tǒng)采購于Sigma公司；試驗中所用的抗體如：bcl-2、bax、AMPK、pAMPK及mTOR等抗體均采購于美國Abcam公司。

1.3 MTT測細胞存活率

提取本單位培養(yǎng)的對數(shù)生長期CNE-2細胞并在其中加入胰酶予以處理，隨后完成計數(shù)和調(diào)整密度等工作，在孔板中進行接種，當CNE-2細胞貼壁后去除原培養(yǎng)液并向其中加入含藥物的新培養(yǎng)液，試驗用藥物為辛伐他汀稀釋液，實驗分為4組，各組中辛伐他汀終濃度分別為0 mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L、10mmol/L，其中辛伐他汀0mmol/L為對照組，在細胞培養(yǎng)24h、48h、72h時添加，并向孔板中加入5mg/mL MTT每孔20μL，靜置4h后棄上清液并向其中加入150μL的DMSO隨后進行振蕩，在波長為570nm的光源照射下測吸光度值。試驗重復(fù)三次。

1.4 Annexin V-FITC/PI流式細胞儀檢測

提取本單位培養(yǎng)的對數(shù)生長期CNE-2細胞并將細胞濃度為5×104/mL的進行接種處理，采用不同濃度辛伐他汀對每組細胞作用相同時間，均為48h，并向其中按1×106/mL密度混入緩沖液重懸，根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒測試指導(dǎo)說明完成相應(yīng)的檢測操作，加入5μlLAnnexin V-FITC，避光10min后在離心機中進行離心處理，棄上清，并加入緩沖液重懸，加入10μlLPI染色液充分混合后在溫度為4℃的恒溫箱中進行避光染色15min，處理完成后在0.5h內(nèi)完成檢測。試驗重復(fù)三次。

1.5 Transwell實驗測細胞侵襲遷移能力

CNE-2細胞接種于24孔板，調(diào)整細胞濃度為2×105/mL，加入藥物處理48h后，在Transwell小室上、下室之間的微孔膜上鋪上Matrigel溶液50μL，并置于溫度為37℃恒溫箱中完成聚合，聚合時間為30min。隨后將不同實驗組細胞進行洗滌和消化。在完成細胞收集后分別置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d，向每組中加入0.5%結(jié)晶紫染液并完成室溫孵育10min。去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細胞，觀察并統(tǒng)計穿過濾膜的細胞個數(shù)，隨機選取5個視野計數(shù)均值。遷移能力測定則transwell小室上室無需采用Matrigel溶液包被，其余步驟同前。

1.6 Western blot方法檢測辛伐他汀對人鼻咽癌細胞CNE-2的BAX、BCL-2、AMPK、pAMPK、mTOR等相關(guān)蛋白的表達影響

提取本單位培養(yǎng)的對數(shù)生長期CNE-2細胞并將濃度為5×104/mL的細胞接種于培養(yǎng)皿中，采用藥物作用細胞48h，向其中加入胰酶完成消化收集，將收集的細胞作為觀察組并取與收集細胞等量的蛋白質(zhì)進行12%SDS-PAGE凝膠電泳處理，并轉(zhuǎn)入PVDF膜向其中加入5%脫脂奶粉，隨后置于恒溫4℃保溫箱中過夜，將封閉過夜的細胞稀釋于0.5%BSA液中，在印跡膜室溫孵育2h并取出，利用TBST洗膜10min×3次，然后用0.5%BSA液稀釋的二抗與印跡膜在室溫孵育2h加入TBST液洗膜15min×3次，通過凝膠成像儀進行成像觀察分析。

1.7 辛伐他汀對CNE-2鼻咽癌細胞中丙二醛量（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

取對數(shù)生長期細胞CNE-2，用0.5%的胰蛋白酶消化，并以培養(yǎng)液調(diào)整成1×105/mL的單細胞懸液。按2mL／孔接種單細胞懸液于6孔細胞培養(yǎng)板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。然后換含有辛伐他汀的培養(yǎng)液，濃度同前，培養(yǎng)48h后收集細胞，采用超聲波破碎（功率300w，破碎25s，間歇25s）。離心收集上清，選用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒分別對MDA和SOD進行檢測，蛋白含量采用brandford法進行測定。

1.9 統(tǒng)計分析

上述試驗所得數(shù)據(jù)通過Mean±SD予以表示，并采用SPSS17.0軟件完成統(tǒng)計學檢測，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中Tukey's法完成比較，以P<0.05為有統(tǒng)計學差異，P<0.01為有高度統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT測辛伐他汀對CNE-2細胞存活率的影響

以對照組存活率作為100%，辛伐他汀0.1mmol/L作用24h、48h、72h人鼻咽癌CNE-2細胞存活率分別為88.3%±3.72%、82.4%±4.59%、78.3%±5.29%。辛伐他汀1mmol/L作用24h、48h、72h存活率分別為80.8%±5.14%、73.7%±4.98%、60.8%±6.38%。辛伐他汀10mmol/L作用24h、48h、72h存活率分別為66.3%±4.85%、57.3%±5.24%、45.7%±7.26%。使用辛伐他汀處理后，CNE-2的細胞存活率顯著下降，且細胞存活率對照組>辛伐他汀0.1mmol/L>1mmol/L>10mmol/L，辛伐他汀各組細胞存活率24h>48h>72h，說明辛伐他汀對人鼻咽癌CNE-2細胞具有一定抑制功能，且藥物濃度和作用時間同抑制人鼻咽癌CNE-2細胞增值效果呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。其中，辛伐他汀濃度為0.1mmol/L作用24h及48h與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余各組與對照組相比均具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）（見圖1）。

2.2 Annexin V-FITC/PI流式細胞儀檢測辛伐他汀對CNE-2細胞凋亡率的影響

對照組細胞凋亡率2.5%±0.5%，藥物濃度分別為0.1、1、10mmol/L時凋亡率分別為6.1%±1.3%、24.3%±3.9%、44.1%±4.8%，結(jié)果表明辛伐他汀對人鼻咽癌CNE-2細胞具有抑制增值和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用，且誘導(dǎo)效果同藥物濃度與作用時間呈正相關(guān)關(guān)系。辛伐他汀各組凋亡率與對照組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）（見圖2，3）。

2.3 辛伐他汀對人鼻咽癌CNE-2細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

隨著辛伐他汀藥物濃度不斷升高，鼻咽癌CNE-2細胞遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)也明顯減少，均少于對照組。辛伐他汀0.1mmol/L與對照組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；辛伐他汀1、10 mmol/L與對照組相比具有顯著統(tǒng)計學差異（P<0.01）。此結(jié)果提示辛伐他汀對鼻咽癌CNE-2細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有抑制作用（見圖4）。

2.4 辛伐他汀對人鼻咽癌CNE-2細胞AMPK/pAMPK/mTOR/BAX/Bcl-2蛋白表達的影響

AMPK是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是膽固醇合成和脂肪代謝關(guān)鍵酶的上游調(diào)節(jié)因子，在能量代謝中起著非常重要的調(diào)控作用，又被稱為“能量傳感器”[18]。辛伐他汀對CNE-2細胞蛋白表達的影響程度為：CNE-2細胞在藥物濃度分別為0、0.1、1、10mmol/L的條件下，AMPK/pAMPK/BAX 和mTOR/Bcl-2表達分別隨藥物濃度增高而逐漸上升和下降，觀察組和對照組的比較差異具有統(tǒng)計學意義（見圖5）。

2.5 辛伐他汀對人鼻咽癌CNE-2細胞MDA含量及SOD活力的影響

鼻咽癌CNE-2細胞MDA含量隨著辛伐他汀濃度升高而升高，SOD活力隨著辛伐他汀濃度升高而下降，其中，辛伐他汀濃度為0.1mmol/L與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），辛伐他汀濃度為1、10mmol/L與對照組相比均具有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）（見圖6）。

3 討論

鼻咽癌是臨床常見頭部惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增長，病人家庭和社會負擔沉重。目前，鼻咽癌治療多為手術(shù)、化療、放療及分子靶向治療模式，但五年生存率低，治療效果欠佳[9]。臨床鼻咽癌病人的治療迫切需要尋找有效的抗鼻咽癌藥物。

辛伐他汀（simvastatin，SIM）是一個經(jīng)典的降血脂藥物，近年來，多項研究顯示，辛伐他汀能夠降低病人腫瘤的發(fā)病率，甚至可以提高惡性腫瘤病人的生存率，進而引起研究者們廣泛興趣，成為研究熱點[9，10]。研究發(fā)現(xiàn)該藥物在臨床治療鼻咽癌具有抑制腫瘤細胞生長的作用，目前辛伐他汀已被用于多項癌癥病人的臨床治療研究[11]。

BAX和BCL-2是BCL-2基因家族中常見的促進細胞凋亡的蛋白質(zhì)，對于控制腫瘤細胞凋亡具有重要作用。本研究顯示，同對照組相對，觀察組采用辛伐他?。?.1、1、10mmol/L）作用于鼻咽癌CNE-2細胞后細胞存活率顯著下降，凋亡率升高（P<0.05），且試驗效果具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，不僅如此該藥物作用后還能增強Caspase-3的活性，促使BAX蛋白過量表達，并抑制Bcl-2蛋白表達水平，試驗結(jié)果表明辛伐他汀可用于臨床治療鼻咽癌，與其他報道相符[12]。

AMPK/mTOR信號通路在細胞增殖、存活、凋亡、糖代謝、基因轉(zhuǎn)錄和細胞遷移中扮演了重要的角色，AMPK作為一種抑癌基因蛋白，是目前腫瘤研究的靶點之一，激活A(yù)MPK能夠抑制mTOR的磷酸化，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，能夠影響腫瘤細胞的增殖、凋亡等多種生物學行為[13]。研究顯示，辛伐他汀能夠作用于AMPK/mTOR途徑進而起到抗膠質(zhì)瘤、卵巢癌、肝癌等腫瘤作用。本研究顯示，辛伐他汀能夠使得AMPK及pAMPK蛋白表達增加，mTOR蛋白表達水平降低，觀察組和對照組試驗結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明辛伐他汀對鼻咽癌CNE-2細胞的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用可能與AMPK/mTOR通路有關(guān)。

丙二醛（MDA）反映氧自由基對組織細胞的損害程度，超氧化物歧化酶（SOD）能夠清除氧自由基，兩者是氧化應(yīng)激系統(tǒng)的標記性物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，辛伐他汀能夠增加MDA含量，減少SOD活性，由此可見辛伐他汀抗鼻咽癌作用可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。綜上所述，辛伐他汀對鼻咽癌細胞增殖抑制、誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制侵襲轉(zhuǎn)移的作用，可能與AMPK/mTOR 通路和氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究為鼻咽癌的治療提供新的思路，還有待進一步深入研究和探討