六靈解毒丸對(duì)急性咽炎的治療作用研究 *

高雨嫣，束安梅，朱逸暉，姚瑤，龔劍，呂高虹，王恒斌，羅年翠，許惠琴

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3.雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 蘇州 215009)

急性咽炎在中醫(yī)學(xué)中被稱(chēng)為“急喉痹”，在古代文獻(xiàn)中多以喉痹為名出現(xiàn)，臨床多見(jiàn)風(fēng)熱外襲型急喉痹，癥狀多為咽喉腫痛、吞咽不利等[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，急性咽炎一般是由細(xì)菌或病毒或環(huán)境變化，喜食刺激辛辣食物而引起炎癥[2-3]。炎癥可以波及整個(gè)咽部，或局限于鼻咽、口咽或喉咽的一部分，患者多有咽干、咽部灼熱、咽黏膜充血、咽痛等癥狀[4]。六靈解毒丸是由人工牛黃、珍珠、石菖蒲、雄黃、蟾酥等藥經(jīng)加工制成的微丸，具有清熱解毒、消腫止痛的作用[5]，臨床治療小兒急性咽炎具有良好的療效。為了揭示其治療機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)采用氨水刺激法建立幼齡大鼠急性咽炎模型，同時(shí)采用小鼠毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)與耳腫脹實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察其抗炎作用特點(diǎn)，為其臨床治療有效性提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及試劑

六靈解毒丸，由雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，批號(hào)：RAO2001。藍(lán)芩口服液，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：19010422。生理鹽水，中國(guó)大冢制藥有限公司，批號(hào)：1901101。25%氨水，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190705。多聚甲醛，Servicebio公司，批號(hào)：XS191316。IL-1β抗體，Abcam公司，批號(hào)：GR309542-28。IL-6抗體，Abcam公司，批號(hào)：GR3190303-16。TNF-α抗體，Abcam公司，批號(hào)：GR3272631-3。IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：201912，規(guī)格：96T。β-actin抗體，Bioworld公司，批號(hào)：AA1217J7525ACTB1。辣根酶標(biāo)記山羊抗兔二抗，Cell Signaling公司，批號(hào)：28。辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，BOSTER公司，批號(hào)：7074P2。RIPA裂解液，索萊寶科技有限公司，批號(hào)：R0020。PMSF，索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P0100。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠、SPF級(jí)ICR小鼠，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用單位為南京中醫(yī)藥大學(xué)，使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2018-0049。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)：201908A019，201910A030。以上動(dòng)物均飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄分籠，用鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫20～23 ℃，濕度44%～57%。

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)鼠顆粒飼料，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1.3 儀器

咽喉給藥器，江蘇平安醫(yī)療器械有限公司。TD6001電子天平，天津市天馬儀器廠(chǎng)。FA2104電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司。Direct-Q超純水儀，美國(guó)MILLIPORE公司。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。Synergy HT酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司。

2 方法

2.1 六靈解毒丸對(duì)氨水誘發(fā)的幼齡大鼠急性咽炎的治療作用研究

2.1.1 分組、造模以及給藥 取幼齡SD大鼠50只，體質(zhì)量100～120 g，雌雄各半，用喉頭噴霧器將15%的氨水向大鼠咽部噴霧(散布面積150 mm2)，每天上下午各1次，每次噴3下(0.3 mL)，連續(xù)噴3 d。使大鼠咽部黏膜因氨水急性刺激而出現(xiàn)明顯紅腫以形成急性咽炎模型。造模后次日，將大鼠隨機(jī)分為5組，即模型組：生理鹽水10 mL/kg；藍(lán)芩口服液組：5 mL/kg(相當(dāng)于臨床等效劑量)；六靈解毒丸3個(gè)劑量組：4.375、8.75、17.5 mg/kg(相當(dāng)于臨床等效劑量的0.5倍、1倍、2倍)。各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。同時(shí)另取10只大鼠(雌雄各半)作為空白組，每天灌胃給予生理鹽水1次，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后大鼠隔夜禁食12 h，用0.3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。并取咽黏膜下的結(jié)締組織備用。

2.1.2 大鼠體征、體質(zhì)量情況 造模及給藥期間每天觀(guān)察大鼠的體征變化，如皮毛光澤度、皮毛脫落情況、活動(dòng)情況、墊料潔凈情況、飲食情況等，并在造模前、造模后、給藥后分別測(cè)定大鼠的體質(zhì)量。

2.1.3 大鼠咽喉局部情況 造模及給藥期間每天觀(guān)察大鼠的咽喉部位色變情況，如咽喉部紅腫程度、顏色深淺等。大鼠咽部紅腫程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[6]：①-：咽部無(wú)異常，計(jì)0分；②+：咽部略有泛紅，計(jì)1分；③++：咽部有明顯紅腫充血的現(xiàn)象，且大鼠時(shí)常抓撓，計(jì)2分；④+++：咽部有明顯紅腫充血的現(xiàn)象，且有潰爛處，計(jì)3分。

2.1.4 大鼠咽部組織的病理變化 取大鼠咽部組織，于4%甲醛溶液中固定，梯度乙醇逐步脫水，用純二甲苯透明組織，純石蠟包埋凝固，4 ℃存放，備用。修塊，并切片，每一片約4 μm，烤片過(guò)夜，HE染色，用中性樹(shù)脂封片，并在光鏡下觀(guān)察每組大鼠咽喉組織病變程度，按病變程度記為1分(輕度)，2分(中度)，3分(重度)。

2.1.5 六靈解毒丸對(duì)大鼠血清和組織中炎癥因子的影響 將大鼠麻醉，取腹主動(dòng)脈血，離心，取上清(血清)后，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)吸收度。

處死大鼠后，取部分大鼠咽部組織，采用免疫組化法：石蠟切片脫蠟至水→抗原修復(fù)→阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶→BSA封閉→加一抗4 ℃過(guò)夜→PBS洗滌→加二抗室溫孵育50 min→DAB顯色→復(fù)染細(xì)胞核→脫水封片→顯微鏡鏡檢→圖像采集分析檢測(cè)大鼠咽部組織中IL-1β、IL-6、TNF-α，利用Image J軟件進(jìn)行定量。

取部分大鼠咽部組織，加入RIPA裂解液，提取大鼠咽部組織蛋白，加入上樣緩沖液，95 ℃金屬浴5 min后備用。SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入BSA(0.5 g/L)室溫封閉2 h，然后加入一抗，4 ℃過(guò)夜。第2天，用PBST洗膜4次，每次15 min。分別加入二抗，室溫孵育2 h后，再用PBST洗膜4次，每次15 min，ECL顯色。以β-actin作為內(nèi)參，利用Image J軟件分析IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的灰度值，進(jìn)行計(jì)算定量。

2.2 小鼠毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)

取ICR小鼠72只，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半。按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組：空白組，模型組，藍(lán)芩口服液組，六靈解毒丸3個(gè)劑量組(8.75、17.5、35 mg/kg)，各組按10 mL/kg每日灌胃給藥1次，空白組與模型組用等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥3 d。末次給藥30 min后，尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)0.01 mL/g，同時(shí)每只小鼠腹腔注射0.2 mL 0.6%乙酸。20 min后脫頸椎處死小鼠，用5 mL生理鹽水沖洗腹腔，用注射器抽出腹腔洗液約4.5 mL。2 000 r/min離心5 min。于590 nm處測(cè)定腹腔洗液吸光度(OD)值[7]。

2.3 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)

取體質(zhì)量為25～27 g的ICR雄性小鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組：對(duì)照組，藍(lán)芩口服液組，六靈解毒丸3個(gè)劑量組(8.75、17.5、35 mg/kg)，各組按10 mL/kg每日灌胃給藥1次，對(duì)照組用等量的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥3 d。末次給藥30 min后用二甲苯40 μL涂于小鼠左耳兩側(cè)。在致炎1 h后處死小鼠，剪下左右兩耳，用打孔器(直徑9 mm)分別在同一部位取下圓耳片，電子天平稱(chēng)耳片質(zhì)量，并比較各組小鼠耳腫脹度(左耳片質(zhì)量-右耳片質(zhì)量)，計(jì)算小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率[8]。腫脹抑制率計(jì)算公式如下：腫脹抑制率=(對(duì)照組平均耳片腫脹度-給藥組平均耳片腫脹度)/對(duì)照組平均耳片腫脹度×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠體征、體質(zhì)量觀(guān)察

造模前，所有大鼠狀態(tài)均良好。空白組狀態(tài)正常，毛色光亮，活動(dòng)正常。造模后大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)欠佳并懶動(dòng)，體毛凌亂無(wú)光澤，頻飲水，納食少，口腔分泌物增加，體質(zhì)量增加緩慢，并出現(xiàn)動(dòng)物死亡的現(xiàn)象。給予藍(lán)芩口服液、六靈解毒丸后，大鼠體征明顯改善、體質(zhì)量增加速度加快，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 大鼠咽喉局部情況

造模3 d后大鼠咽喉部均出現(xiàn)++至+++的紅腫，表明模型成功。給予藍(lán)芩口服液和六靈解毒丸后，大鼠咽喉紅腫程度降低，其中以六靈解毒丸中、高劑量組治療效果較好，且六靈解毒丸中、高劑量組與藍(lán)芩口服液組間有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 六靈解毒丸對(duì)氨水刺激幼齡大鼠體質(zhì)量的影響

表2 六靈解毒丸對(duì)氨水刺激幼齡大鼠咽喉紅腫評(píng)分的影響

3.3 大鼠咽部組織的病理變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組大鼠咽部組織結(jié)構(gòu)正常，如圖1A所示，氣管黏膜層無(wú)明顯脫落、損傷，黏膜下層腺體結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)結(jié)締組織增生，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠咽部組織結(jié)構(gòu)異常，如圖1B所示，部分黏膜下層區(qū)域可見(jiàn)大量結(jié)締組織增生，如黑色箭頭所示;該區(qū)域黏膜上皮細(xì)胞嚴(yán)重增生，黏膜層明顯增厚，如黃色箭頭所示；黏膜下層可見(jiàn)少量細(xì)胞壞死，如綠色箭頭所示；少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，如紅色箭頭所示。給予藍(lán)芩口服液(圖1C)和六靈解毒丸(圖1D～F)之后，大鼠咽部組織結(jié)構(gòu)有明顯改善，大鼠咽部組織結(jié)構(gòu)與黏膜下層腺體結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，氣管黏膜層偶有脫落、損傷，少見(jiàn)結(jié)締組織增生與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中六靈解毒丸中、高劑量組的改善作用更明顯(P<0.01)。

3.4 六靈解毒丸對(duì)大鼠血清和組織中炎癥因子水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予幼齡大鼠氨水刺激后，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯上升(P<0.01)。而與模型組相比，所有給藥組均可明顯下調(diào)大鼠血清中的IL-1β、TNF-α水平(P<0.05～0.01)，以六靈解毒丸高劑量組效果較佳；六靈解毒丸中、高劑量組可明顯下調(diào)大鼠血清中的IL-6水平(P<0.05～0.01)。免疫組化和Western blot結(jié)果也顯示,模型組大鼠組織中的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯上升。與模型組相比，藍(lán)芩口服液組和六靈解毒丸中、高劑量組可不同程度地下調(diào)大鼠組織中的IL-1β、IL-6、TNF-α水平，以六靈解毒丸高劑量組較佳。如圖2～6所示。

3.5 六靈解毒丸對(duì)乙酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藍(lán)芩口服液、六靈解毒丸中、高劑量組均可明顯降低乙酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性，與模型組比較均有明顯差異(P<0.05～0.01)。見(jiàn)表3。

3.6 六靈解毒丸對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在二甲苯致炎作用下，各組小鼠左耳均出現(xiàn)腫脹，而中、高劑量六靈解毒丸均可降低耳腫脹度，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05～0.01)，且隨劑量的增加，耳腫脹的抑制作用更明顯。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，六靈解毒丸中、高劑量組抑制耳腫脹作用強(qiáng)于藍(lán)芩口服液組，與藍(lán)芩口服液組比較具有顯著性差異(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 六靈解毒丸對(duì)乙酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性的影響

表4 六靈解毒丸對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

4 討論

急性咽炎臨床上以西藥治療為主，多用抗生素，如青霉素等，但是易產(chǎn)生耐藥性。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，五臟六腑之“火”都會(huì)上沖口喉部位，正所謂“咽喉口齒諸病，皆屬于火”。咽喉的紅腫、疼痛、化膿等均歸為“火”的表現(xiàn)。故本病宜采用疏風(fēng)解表、清熱解毒的方法治療。六靈解毒丸的主藥人工牛黃可解熱鎮(zhèn)痛、抗病原微生物[9]，臨床用于治療咽喉腫痛，口舌生瘡，癰腫疔瘡。

炎癥是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng)，表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙[10]，其病變雖然多在局部，但特殊部位炎癥會(huì)導(dǎo)致并發(fā)癥出現(xiàn)，如嚴(yán)重的心肌炎可導(dǎo)致心臟功能受損[11]。IL-1β、IL-6、TNF-α均為急性炎癥相關(guān)的重要指標(biāo)。IL-1β、IL-6能促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化并產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生炎癥[6,12]，TNF-α是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的炎癥因子，其水平升高可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]。三者可相互促進(jìn)，使炎癥細(xì)胞聚集、活化和釋放炎癥介質(zhì)，加重炎癥癥狀[14]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氨水噴霧可使大鼠咽喉部因急性刺激而充血腫脹，形成急性炎癥，該模型能夠維持10 d[15]。故本研究采用氨水噴霧刺激的方法制備幼齡大鼠急性咽炎模型。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人工牛黃對(duì)醋酸引起的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加以及肉芽組織增生均有抑制作用，另外還可以減輕電刺激、熱刺激、醋酸等導(dǎo)致的小鼠疼痛[9,16]。故本實(shí)驗(yàn)建立了乙酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性增加的模型以及二甲苯致小鼠耳腫脹的模型。結(jié)果表明，六靈解毒丸中、高劑量均可明顯降低乙酸所致小鼠毛細(xì)血管通透性，并能夠降低耳腫脹度，與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05～0.01)，且隨劑量的增加，耳腫脹的抑制作用更明顯，六靈解毒丸中、高劑量組抑制耳腫脹作用略強(qiáng)于藍(lán)芩口服液，2組比較具有顯著性差異(P<0.05)。說(shuō)明六靈解毒丸對(duì)化學(xué)性刺激導(dǎo)致的炎癥也有一定的對(duì)抗作用。

綜上所述，本研究對(duì)六靈解毒丸治療急性咽炎進(jìn)行了藥效研究，證實(shí)了六靈解毒丸對(duì)于化學(xué)刺激所致的急性咽炎具有良好的治療作用，其機(jī)制可能與下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α水平相關(guān)，為后續(xù)的臨床推廣應(yīng)用積累了良好的學(xué)術(shù)證據(jù)。