細(xì)胞聯(lián)合生物材料應(yīng)用于脊髓損傷治療的研究進(jìn)展

周甜甜，蘇文杰，廖維靖

流行病學(xué)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)的全球發(fā)病率約為236～1 009/百萬人，男女比例接近5∶2[1-2]，造成了勞動力的大量喪失。雖然已有諸多臨床指南推薦利用神經(jīng)營養(yǎng)藥物、物理治療、輔助支具等策略來改善SCI患者的功能，但其臨床治療效果并不一致。又由于SCI復(fù)雜的病理生理特點(diǎn)，使得在動物實驗中有效的干預(yù)手段，并不能在患者身上得到結(jié)果重現(xiàn)，極大地限制了SCI的治療進(jìn)展。近年來，隨著對細(xì)胞治療領(lǐng)域的不斷探索，尤其是2006年誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)的發(fā)現(xiàn)[3]，利用細(xì)胞或其制品治療SCI的概念得到空前的發(fā)展。而生物材料的應(yīng)用，從一定程度上又能增強(qiáng)細(xì)胞移植治療SCI的效果[4-5]，現(xiàn)將圍繞這兩個方面的研究結(jié)果闡述其在SCI治療中的應(yīng)用。

1 SCI的病理生理

按時間順序，SCI可分為急性期，亞急性期以及慢性期三個階段[6-7]。其病理機(jī)制主要包括：血運(yùn)障礙、再灌注損傷、神經(jīng)興奮毒性、鈣超載、電解質(zhì)紊亂、免疫炎性損傷、細(xì)胞凋亡和線粒體功能紊亂等[8]。①急性期：a.主要病理變化：血管破壞、出血、缺血；興奮毒性；自由基的過量產(chǎn)生；炎癥反應(yīng)；血腦屏障的破壞。b.影響：鈣離子的過載→線粒體功能障礙和細(xì)胞質(zhì)一氧化氮合酶和磷脂酶A2的激活→微血管損傷和后續(xù)缺血[9-11]；興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸，天冬氨酸)過度活化→神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(尤其是少突膠質(zhì)細(xì)胞)的凋亡；自由基的過量產(chǎn)生→脂質(zhì)過氧化→膜損傷，細(xì)胞裂解，細(xì)胞器功能障礙，細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)；內(nèi)皮細(xì)胞的破壞，星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的喪失，各種炎性細(xì)胞因子引起的通透性增加→血腦屏障的破壞。②亞急性期：a.主要病理變化：吞噬反應(yīng)；星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖。b.影響：星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增殖→星形細(xì)胞膠質(zhì)瘢痕形成→阻礙軸突再生。③慢性期：a.主要病理變化：瘢痕形成；脫髓鞘；Wallerian變性；神經(jīng)細(xì)胞表面的離子通道持續(xù)性受損。b.影響：阻礙髓鞘和軸突的再生。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為減輕或修復(fù)SCI后的繼發(fā)性病理損害是其治療的首要目標(biāo)[6]。

2 細(xì)胞移植與SCI

由于神經(jīng)元再生能力有限，在發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，極易遺留不可恢復(fù)的神經(jīng)功能障礙。雖然經(jīng)過甲強(qiáng)龍或神經(jīng)營養(yǎng)藥物、規(guī)范的康復(fù)治療等手段，SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的程度依然有限。因此，還需要探索新的治療方法，以促進(jìn)SCI后的功能恢復(fù)。數(shù)十年前，已有研究利用細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[9]，隨著近年來細(xì)胞分化技術(shù)、移植手段等的發(fā)展，細(xì)胞移植應(yīng)用于SCI治療也備受行業(yè)關(guān)注。

目前，用于SCI治療的細(xì)胞主要包括：嗅鞘細(xì)胞(Olfactory Ensheathing Cell，OEC)、施旺氏細(xì)胞(Schwann Cell，SC)、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem cell，MSC)，以及胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell，ESC)或iPSC來源的前體細(xì)胞等。多項研究表明，細(xì)胞移植可能是安全而且有效的SCI治療方法，對SCI后的運(yùn)動、感覺或自主神經(jīng)功能恢復(fù)都有一定的效果[12-15]。盡管這些細(xì)胞在移植入損傷脊髓后的確切作用機(jī)制尚不清楚，但抑制凋亡活動、免疫調(diào)節(jié)作用、釋放腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glialcellline-Derived Neurotrophic Factor，GDNF)等神經(jīng)營養(yǎng)因子、促進(jìn)血管再生、促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞再生、移植膠質(zhì)疤痕的形成、調(diào)節(jié)生物酶活動或促進(jìn)軸突功能等機(jī)制可能與SCI后的功能恢復(fù)密切相關(guān)[16]。而移植不同類型的細(xì)胞對SCI的治療發(fā)揮的作用又有所不同，對逆轉(zhuǎn)SCI后的病理變化意義重大，可能為SCI的損傷修復(fù)提供新的靶點(diǎn)。

3 生物材料與SCI

SCI是個復(fù)雜的病理生理過程。SCI發(fā)生后，不僅破壞了原有的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，對功能也有不同程度的損害。因此，要想重建和修復(fù)SCI后的結(jié)構(gòu)和功能，至少需要移植細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)重建這一結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，而現(xiàn)有的單純細(xì)胞移植方法并不能實現(xiàn)這一目標(biāo)。生物材料的應(yīng)用恰能解決這一難題，有望為移植的細(xì)胞提供支持、營養(yǎng)等作用，已引起了足夠重視。

目前使用的比較多的生物材料有透明質(zhì)酸、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖、基質(zhì)膠、膠原蛋白或纖維蛋白及合成聚合物，如聚乳酸(Poly(D, L-lactic acid)，PLA)、聚乙醇酸(poly-glycolic acid，PGA)、聚乳酸-羥基乙酸復(fù)合高聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚甲基丙烯酸2-羥乙酯(Poly(2-hydroxyethylmethacrylate)，pHEMA)或聚丙交酯(Poly(lactide-co-glycolide)，PLG)[17-18]。生物材料不僅可以橋接受損區(qū)域，促進(jìn)軸突延伸和細(xì)胞遷移，還可以作為神經(jīng)營養(yǎng)或調(diào)節(jié)藥物的載體，甚至與細(xì)胞聯(lián)合治療SCI時，對移植細(xì)胞有一定的營養(yǎng)和保護(hù)作用，以實現(xiàn)細(xì)胞治療功能[19]。研究發(fā)現(xiàn)，將具有單軸通道的瓊脂糖支架植入受損的大鼠脊髓中[20]，瓊脂糖支架可以很好地整合到宿主組織中，并且在手術(shù)后1個月觀察到軸突生長。在一項兔SCI模型中，將膠原細(xì)絲移植到兔脊髓中，也觀察到軸突再生，且與未治療的對照組相比，移植組中觀察到兔運(yùn)動功能的改善[21]。在犬SCI實驗中，神經(jīng)再生膠原支架能夠減少損傷面積，引導(dǎo)神經(jīng)纖維有序再生[22-24]。不僅如此，Wen等[25]將攜帶生長因子(血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)與 BDNF )的聚乳酸微球粒置入管狀的透明質(zhì)酸支架中治療SCI大鼠，也取得了明顯的治療作用。

4 生物材料結(jié)合細(xì)胞移植治療SCI

單純的細(xì)胞移植治療SCI在闡明細(xì)胞修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，然而，實際的應(yīng)用中，還需要解決移植細(xì)胞低生存率，不受控制的分化和細(xì)胞植入后功能恢復(fù)有限的問題[26]。這些問題與SCI后形成的不利微環(huán)境有關(guān)，目前對于損傷微環(huán)境形成的機(jī)制尚不清楚，主要與神經(jīng)細(xì)胞的死亡，神經(jīng)損傷部位促進(jìn)再生的營養(yǎng)因子缺乏，阻礙神經(jīng)再生的瘢痕組織及某些化學(xué)分子的形成，神經(jīng)再生抑制因子的作用等有關(guān)[27-28]。生物材料支架不僅可以橋接病變的間隙，為移植的細(xì)胞植入提供物理支持，并將植入的細(xì)胞與宿主組織分離，從而為細(xì)胞分化和增殖提供獨(dú)立的微環(huán)境；還可以作為傳送細(xì)胞和生物分子的載體，改變受損部位的微環(huán)境[29]。生物材料支架還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化成所需的細(xì)胞[30]。正是因為生物材料支架的多種優(yōu)勢，研究人員將細(xì)胞嵌入各種生物材料中，以探究生物材料結(jié)合細(xì)胞移植的協(xié)同作用。Chen等[31]發(fā)現(xiàn)非細(xì)胞生物支架可以提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率，促進(jìn)其遷移和分化，還可以減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)宿主組織以及促進(jìn)SCI后的功能修復(fù)。Zhou等[32]將載有活化的許旺氏細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells，NSCs)的聚己內(nèi)酯支架用于治療SCI大鼠，結(jié)果表明細(xì)胞在支架上生長良好且該方法縮小了病變腔的體積，促進(jìn)了大鼠運(yùn)動功能的恢復(fù)。Ferrero等[33]用接種了來源于脂肪的干細(xì)胞和OECs的新型血清衍生的白蛋白支架治療SCI大鼠，45d后發(fā)現(xiàn)該支架在填充病變腔和減少神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成具有重要作用。用人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞接種的非細(xì)胞生物支架能夠橋接脊髓腔并促進(jìn)SCI大鼠的軸突再生和功能恢復(fù)[34]。因此生物材料支架結(jié)合細(xì)胞移植可能具有以下優(yōu)點(diǎn)：在特定生物材料支架的背景下，細(xì)胞及損傷灶周圍的神經(jīng)細(xì)胞的存活率可能會更高，移植的細(xì)胞可受到不同生物材料的結(jié)構(gòu)、材料生化特性等影響，其分化受到調(diào)控[4-5, 35]。

4.1 膠原結(jié)合細(xì)胞移植 膠原蛋白是哺乳動物中最常見的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，已被廣泛用作支架研究，以促進(jìn)嚙齒動物SCI后的軸突再生[36]。研究發(fā)現(xiàn)，將接種了大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的膠原支架植入完全性SCI大鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷部位空腔的體積明顯縮小，即重建了部分損傷的脊髓結(jié)構(gòu)[37]。Zhao等[38]將帶有人臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的膠原支架植入8名慢性完全性SCI患者中，通過1年的隨訪，并未觀察到不良事件(包括感染，發(fā)熱，頭痛，過敏反應(yīng)，休克，圍手術(shù)期并發(fā)癥，神經(jīng)系統(tǒng)狀態(tài)加重或癌癥)，甚至在一些患者中觀察到功能的改善(包括軀干穩(wěn)定性增強(qiáng)，排便感覺和自主神經(jīng)功能恢復(fù))。Xiao等[39]也報道了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合膠原支架治療2例急性SCI患者的案例，同樣未記錄到相關(guān)的副作用，但對2名患者的感覺和運(yùn)動功能的恢復(fù)都有促進(jìn)作用。

4.2 藻酸鹽水凝膠結(jié)合細(xì)胞移植 藻酸鹽是從棕色海藻中提取的水溶性多糖，通常作為一種黏合劑或者穩(wěn)定劑，配合其它治療方法使用。Günther等[4]將藻酸鹽水凝膠和骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用于SCI大鼠中，結(jié)果表明，藻酸鹽支架可以為SCI大鼠中的軸突再生提供物理連接，并且促進(jìn)軸突再生；急性期研究也證實了其聯(lián)合應(yīng)用的有效性，術(shù)后6周的結(jié)果提示BBB 評分可較單獨(dú)細(xì)胞移植組提高70%，較單獨(dú)材料組提高40%[40]。

4.3 聚乳酸-羥基乙酸復(fù)合高聚物(PLGA)結(jié)合細(xì)胞移植 PLGA是一種高分子材料。在一項研究中[41]，將接種了胚胎大鼠的神經(jīng)干細(xì)胞的PLGA支架植入完全性SCI大鼠中，一個月后，與單獨(dú)植入支架組相比，可以觀察到更多的軸突，而且支架能有效提高NSCs的存活率。在更具臨床相關(guān)性的SCI模型中，Pritchard等[41]將接種了人的神經(jīng)干細(xì)胞的PLGA支架植入非洲綠猴受損的脊髓中，結(jié)果表明植入受試者中的支架至少可以持續(xù)40d，這為植入的神經(jīng)干細(xì)胞提供了足夠的時間來分裂和分化。

4.4 其它生物材料結(jié)合細(xì)胞移植 殼聚糖、瓊脂糖、纖維蛋白等在SCI的治療中也顯示了顯著的作用。硬膜外壓迫損傷后3周，實驗組大鼠脊髓中植入由神經(jīng)干細(xì)胞和前體細(xì)胞接種的殼聚糖支架，對照組直接將細(xì)胞注射到受損的脊髓中。移植6周后，與細(xì)胞注射組相比，支架植入組損傷部位存活的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量更多[42]。在一項研究中[43]，將骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合瓊脂糖置入大鼠受損的脊髓中，結(jié)果顯示損傷部位神經(jīng)軸突出現(xiàn)生長。纖維蛋白水凝膠不僅能為細(xì)胞移植創(chuàng)造良好的環(huán)境，改善與宿主組織的整合，還能減少瘢痕組織的形成[44]。還有一些研究表明PLA和透明質(zhì)酸也是良好的生物材料[45-46]。

5 結(jié)論

功能恢復(fù)是SCI治療的初級目標(biāo)，要想實現(xiàn)SCI后的結(jié)構(gòu)重建，對其治療也提出了更高的要求。利用細(xì)胞移植結(jié)合生物材料治療SCI，從一定程度上可以兼顧二者，正越來越受到研究者們的關(guān)注。但鑒于當(dāng)前的研究結(jié)果多數(shù)來自動物實驗，人與動物解剖結(jié)構(gòu)的差異，SCI后損傷與修復(fù)同時存在，并且人與動物的自我修復(fù)能力的差別等，目前將兩者應(yīng)用于臨床的研究不多，所以如何更好地將動物研究轉(zhuǎn)化成臨床仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的問題。此外還有一些亟待解決的問題，首先是細(xì)胞移植的安全性，尤其是一些數(shù)據(jù)表明iPSCs具有導(dǎo)致腫瘤的風(fēng)險，神經(jīng)干細(xì)胞可能會導(dǎo)致畸胎瘤的形成，而用于治療脊髓損傷最廣泛的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，尚缺乏其能分化成功能性神經(jīng)元的證據(jù)[47-48]。其次是生物材料支架和細(xì)胞移植的時機(jī)，如果在急性期就干預(yù)，可能會放大治療效果，因為無法評估患者的自然恢復(fù)程度。最后是移植方法，細(xì)胞移植包括鞘內(nèi)注射、靜脈注射、病灶移植、自體移植等，不同的移植方法可能對結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。SCI的修復(fù)是個極其復(fù)雜的過程，隨著生物工程、基因工程的發(fā)展，生物材料結(jié)合細(xì)胞移植的研究有力地促進(jìn)了SCI的治療向聯(lián)合的道路前進(jìn)。