金絲楸優(yōu)良無性系遺傳多樣性和親緣關(guān)系的AFLP 分析

馬慶國(guó)，王治軍，徐慧敏，李明昆，李慧民，張俊佩＊，張建國(guó)

(1. 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 洛陽(yáng)農(nóng)林科學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000；3. 洛寧縣林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，河南 洛陽(yáng) 471700；4. 和田地區(qū)林業(yè)和草原局，新疆 和田 848000；5. 喀什地區(qū)林業(yè)技術(shù)推廣站，新疆 喀什 844000)

楸樹（Catalpa bungei C. A. Mey.）原產(chǎn)中國(guó)，是紫葳科（Bignoniaceae）梓屬（Catalpa Scop.）的高大落葉喬木，由于其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較好、生長(zhǎng)速度迅速、木材材質(zhì)優(yōu)良，同時(shí)具用材和觀賞兩方面的特性，是理想的復(fù)合農(nóng)林業(yè)建設(shè)樹種[1]。金絲楸是楸樹中的類型之一，在河南、山東、江蘇、安徽等省有自然分布，由于它干型好、生長(zhǎng)快、材性好、木材剖面色澤金黃，因此，在楸樹適生區(qū)域備受青睞。河南是我國(guó)金絲楸的主產(chǎn)區(qū)之一，深入研究金絲楸優(yōu)異種質(zhì)資源，認(rèn)識(shí)其遺傳多樣性水平、明確其親緣關(guān)系，可以為金絲楸種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供理論支持。

楸樹種質(zhì)資源研究始于20 世紀(jì)70 年代，早期主要是采用形態(tài)學(xué)的方法，姚慶渭等[2]研究了分布于亞洲東部和北美洲的梓樹屬不同種的形態(tài)學(xué)特征，建議設(shè)立梓樹組、大梓樹組和楸樹組，其中，楸樹組包括楸樹和灰楸兩個(gè)種。潘慶凱等[3]首次將楸樹和灰楸2 個(gè)種的種質(zhì)資源從生產(chǎn)利用角度劃分成了不同類型并進(jìn)行了詳盡的描述。河南省楸樹研究組在1983 年至1985 年期間對(duì)楸樹和灰楸資源開展了全國(guó)范圍的調(diào)查，將我國(guó)的楸樹種質(zhì)資源在種以下劃分成了11 個(gè)類型，這是我國(guó)目前最為系統(tǒng)的楸樹資源調(diào)查和分類研究[4]。分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用使得楸樹種質(zhì)資源的研究已經(jīng)深入到了分子水平。Li 等[5]采用葉綠體ndhF 序列和核糖體DNA序列對(duì)紫葳科梓屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了探討。石欣等[6]采集了156 個(gè)楸樹不同類型的單株材料，利用 ISSR 分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，其遺傳變異主要存在于類型內(nèi)，且聚類分析發(fā)現(xiàn)，10 個(gè)類型可劃分為4 類。Wang 等[7]從楸樹轉(zhuǎn)錄組中設(shè)計(jì)并篩選了30 對(duì)EST-SSR 引物，這些引物可應(yīng)用于楸樹及其近緣種的遺傳分析。方樂成等[8]應(yīng)用 SSR 分子標(biāo)記解析楸樹種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系，構(gòu)建了其核心種質(zhì)。這些研究的開展為楸樹種質(zhì)資源的保存保護(hù)和開發(fā)利用提供了參考，但在分子水平上對(duì)其遺傳多樣性的研究相對(duì)較少，采用 AFLP 技術(shù)進(jìn)行金絲楸遺傳多樣性分析的研究還未見報(bào)道。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）具有重復(fù)性好、可靠性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[9]，是進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的有效分子標(biāo)記方法，目前已在很多多年生木本植物中成熟應(yīng)用。為了明確金絲楸優(yōu)良無性系的遺傳多樣性，解析其與楸樹種下不同類型及梓樹屬其它種之間的親緣關(guān)系，本研究以75 個(gè)金絲楸優(yōu)良無性系單株和梓樹屬不同類型為研究對(duì)象，應(yīng)用 AFLP 技術(shù)分析它們的遺傳多樣性，建立DNA 指紋圖譜，揭示金絲楸優(yōu)良無性系和楸樹不同類型間的遺傳關(guān)系，為金絲楸品種鑒定提供依據(jù)，同時(shí)也為確定金絲楸的分類地位、種質(zhì)資源保護(hù)及可持續(xù)利用和新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為定植于我國(guó)河南省洛寧縣的75 個(gè)金絲楸優(yōu)良無性系、‘豫楸1 號(hào)’、光葉楸、灰楸和梓樹（圖1、表1），采其健康、無病蟲為害的嫩葉，低溫運(yùn)輸、保存并立即提取其基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 采用改良的CTAB 法[10]提取其基因組DNA。

1.2.2 引物篩選和重復(fù)性驗(yàn)證 從64 對(duì)EcoRⅠ+3/Mse Ⅰ+3 引物組合（上海生工）中篩選出10 對(duì)（表2）用于本研究。選取‘豫楸1 號(hào)’、梓樹等5 個(gè)樣品采用10 對(duì)AFLP 引物進(jìn)行擴(kuò)增，試驗(yàn)重復(fù)3 次，驗(yàn)證其譜帶質(zhì)量和可重復(fù)性。

1.2.3 AFLP 分析 對(duì)供試樣品采用EcoR Ⅰ/MseⅠ內(nèi)切酶（NEB 公司）進(jìn)行雙酶切，酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增程序參考李辛雷等[11]描述的方法進(jìn)行。

1.2.4 電泳檢測(cè) 將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)（100∶1）混合均勻后取9 μL 進(jìn)行上樣，再將PCR 產(chǎn)物稀釋10×后吸取1 μL 加入上樣板，使用3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 基于采樣地點(diǎn)的經(jīng)緯度利用Google earth 和Arcmap 生成采樣地點(diǎn)分布圖。利用GeneMarker 2.2 軟件將79 個(gè)材料10 對(duì)熒光引物毛細(xì)管電泳的檢測(cè)結(jié)果與分子量?jī)?nèi)標(biāo)進(jìn)行比較，得到片段大小，然后根據(jù)無帶和有帶的情況轉(zhuǎn)換為“0/1” 矩陣。采用SPSS 22.0 軟件的simple match 模塊檢驗(yàn)AFLP 試驗(yàn)的可重復(fù)性。用NTSYSpc 2.11F軟件計(jì)算DICE 遺傳相似系數(shù)，并基于相似系數(shù)矩陣采用UPGMA 法(非加權(quán)算術(shù)平均法) 進(jìn)行聚類分析，通過 Tree plot 模塊生成聚類圖；用EIGEN模塊進(jìn)行基于Jaccard 遺傳相似系數(shù)的主坐標(biāo)分析（PCA）[12]，以進(jìn)一步驗(yàn)證并分析聚類結(jié)果。使用POPGENE32 version 1.32 軟件[13]計(jì)算多態(tài)性比例PPBs (percentage of polymorphic bands)，并在假定哈迪-溫伯格平衡的前提下計(jì)算其有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）和Shannon 信息指數(shù)（I）[14]。利用SPSS 22.0軟件基于遺傳距離和地理距離進(jìn)行Mantel 檢驗(yàn)[15]。

圖1 供試樣品采集地點(diǎn)Fig. 1 Geographic location of samples used in the study

表1 供試金絲楸優(yōu)良無性系及其來源 Table 1 Superior clones of Jinsiqiu used in the AFLP analysis and their origin

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

本研究篩選10 對(duì)EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ引物組合對(duì)金絲楸優(yōu)良無性系基因組DNA 進(jìn)行AFLP 分析，擴(kuò)增取得了較好的效果（表2，圖2），擴(kuò)增譜帶清晰、位置一致性良好（重復(fù)性＞92%）?？傮w水平上，10 對(duì)引物組合共擴(kuò)增出1 177 條帶，其中，1 130 條帶是多態(tài)性帶，平均多態(tài)性比例為96.01%；對(duì)75 個(gè)金絲楸無性系而言，總的條帶數(shù)是1 041條，其中，多態(tài)性帶811 條，平均的多態(tài)性比例是77.89%。其中，引物組合E-TCC/ M-CTT 所檢測(cè)的多態(tài)性比例最高為總體水平100% 及金絲楸93.55%，總條帶數(shù)分別為111 條（總體）和93 條（金絲楸）；引物組合E-AAG/ M-CAA 所獲得的總條帶數(shù)最多，為149 條（總體）和128 條（金絲楸）， 其多態(tài)性比例為94.63%（ 總體） 和75.78%（金絲楸）。

2.2 遺傳相似系數(shù)

利用10 對(duì)選擇性引物組合進(jìn)行AFLP 檢測(cè)，79 個(gè)樣品的DICE 遺傳相似系數(shù)范圍為0.413 4～0.905 9，平均為0.811 6。其中，JSQ-54 和JSQ-76的遺傳相似系數(shù)最大為0.905 9，JSQ-37 和梓樹間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.413 4。

2.3 有效等位基因數(shù)、基因多樣度及Shannon 信息指數(shù)分析

基于等位基因頻率計(jì)算有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣度（H）及Shannon 信息指數(shù)（I）是進(jìn)行遺傳多樣性水平評(píng)估的重要方式[12]。表3 表明：10 對(duì)引物所檢測(cè)到的不同位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)范圍為1.00～1.99，平均為1.48±0.03（總體）和1.36±0.04（金絲楸）；基因多樣度為0.00～0.49，平均為0.28±0.01（ 總 體 ） 和0.21±0.02（ 金 絲 楸 ） ；Shannon 信息指數(shù)為0.00～0.69，平均為0.43±0.02（總體）和0.32±0.04（金絲楸）。75 個(gè)金絲楸無性系的有效等位基因數(shù)、基因多樣度和Shannon 信息指數(shù)高于對(duì)白榆無性系[16]、核用銀杏[17]和古銀杏資源[18]的研究結(jié)果（Ne=1.33，H= 0.20，I=0.33；Ne=1.33， H=0.21， I=0.34； Ne=1.26、 H=0.17，I=0.27），低于利用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)觀賞石榴[19]的研究結(jié)果（Ne=1.94，H=0.38，I=0.55）和采用SSR 標(biāo)記對(duì)西藏光核桃[20]的研究結(jié)果，與利用ISSR 技術(shù)對(duì)楸樹種質(zhì)資源[6]的分析（Ne=1.48，H=0.29，I=0.45）及王慶軍等[21]對(duì)對(duì)山東石榴品種（Ne=1.38，H=0.23，I=0.35）的研究較接近。

表2 AFLP 分析引物組合及其選擇性擴(kuò)增結(jié)果 Table 2 Primers used for AFLP and amplification results of Jinsiqiu

圖2 部分金絲楸供試樣品的熒光AFLP 電泳圖譜（引物組合為E-ACT/M-CAA）Fig. 2 Electrophoresis patterns of partly assayed materials of Jinsiqiu superior clones(Primer combination: E-ACT/ M-CTA)

表3 75 個(gè)金絲楸優(yōu)良無性系遺傳多樣性度量指標(biāo)Table 3 Genetic diversity of 75 superior clones of Jinsiqiu

2.4 聚類分析

分析聚類圖（圖3）發(fā)現(xiàn)：當(dāng)閾值設(shè)定為0.46 時(shí)，可將79 個(gè)供試樣品分成2 個(gè)大組（A 和B）：A 組中僅有梓樹（ZiShu），B 組包含了其他78 個(gè)單株。分析B 組成員發(fā)現(xiàn)：75 個(gè)金絲楸無性系首先聚在一起，然后與光葉楸（GYQ）和灰楸（HuiQiu）聚在一起，‘豫楸1 號(hào)’則單獨(dú)聚為一組。

圖3 基于AFLP 分析的金絲楸優(yōu)良無性系UPGMA 聚類圖Fig. 3 UPGMA dendrogram of Catalpa bungei superior clones based on genetic distance

當(dāng)以DICE 遺傳相似系數(shù)平均值（0.827 7）劃分時(shí)，可將79 個(gè)供試材料分為8 個(gè)組（分別標(biāo)記為Ⅰ～Ⅷ），其中，Ⅰ組成員最多，包含71 個(gè)金絲楸無性系，其遺傳相似系數(shù)為0.806 6～0.905 9，JSQ-30 和JSQ-58 間的遺傳相似系數(shù)最小為0.806 6， JSQ-54 和JSQ-76 間的遺傳相似系數(shù)最大為0.905 9，這些無性系的親緣關(guān)系較密切。Ⅲ組包含2 個(gè)無性系，即JSQ-7 和JSQ-8（DICE 遺傳相似系數(shù)0.837 3），它們的母樹均采自羅嶺鄉(xiāng)核桃溝村，親緣關(guān)系較近。JSQ-37 和JSQ-63 分別構(gòu)成了單獨(dú)的組（Ⅱ、Ⅳ）。JSQ-37 的母樹采自羅嶺鄉(xiāng)前陰坡村，JSQ-63 的母樹采自興華鄉(xiāng)瓦寨廟村，這2 個(gè)金絲楸無性系表現(xiàn)出了與其它無性系較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。GYQ、HuiQiu、Yuqiu1 和ZiShu作為種內(nèi)和種間對(duì)照各自聚為一組（Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ），與金絲楸親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。GYQ 是楸樹中不同于金絲楸的一個(gè)類型[4]，它單獨(dú)聚為一組。值得注意的是，在本研究中與近緣種灰楸相比，普通楸樹品種‘豫楸1 號(hào)’與金絲楸的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。

通過NTSYSpc 2.11F 軟件EIGEN 程序進(jìn)行的PCA 分析表明：前2 個(gè)主坐標(biāo)Dim-1 和Dim-2 所能解釋的相關(guān)性為84.94%，PCA 分析結(jié)果與聚類結(jié)果基本一致（圖4），這2 種分析相結(jié)合可以更全面地反映金絲楸優(yōu)良無性系的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。進(jìn)一步對(duì)各無性系的遺傳距離和地理距離進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果呈極顯著正相關(guān)（圖5），表明地理隔離對(duì)楸樹遺傳多樣性有顯著的影響。結(jié)合聚類分析結(jié)果，金絲楸無性系當(dāng)中的63 號(hào)與其他遺傳距離最遠(yuǎn)，值得重點(diǎn)推廣。

圖4 基于AFLP 數(shù)據(jù)的金絲楸優(yōu)良無性系主坐標(biāo)分析（PCA）Fig. 4 PCA analysis of Catalpa bungei superior clones based on AFLP data

圖5 金絲楸優(yōu)良無性系地理距離和遺傳距離的相關(guān)分析Fig. 5 Mantel test for the correlation between geographical distance and genetic distance of Catalpa bungei superior clones

3 討論

楸樹是原產(chǎn)我國(guó)的特色用材和觀賞樹種，金絲楸作為其中一個(gè)類型具有材色金黃、干性優(yōu)良等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛，金絲楸良種的選育也在逐步開展[22]，然而，金絲楸的優(yōu)良品種目前還非常少，對(duì)其種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系開展分子水平上的研究，有利于深入認(rèn)識(shí)金絲楸種質(zhì)資源、進(jìn)一步篩選優(yōu)秀和特異種質(zhì)資源以及制定保護(hù)和可持續(xù)利用策略，同時(shí)也可以為金絲楸雜交育種中的親本選配提供技術(shù)支撐。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于楸樹分子標(biāo)記方面的研究罕有報(bào)道，本文采用熒光AFLP 技術(shù)，篩選10 對(duì)EcoR Ⅰ+3 和MseⅠ+3 引物組合分析75 個(gè)金絲楸優(yōu)良無性系，并以‘豫楸1 號(hào)’、光葉楸、灰楸和梓樹等不同類型為對(duì)照進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析，獲得了高效、穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果，供試樣品間各引物組合檢測(cè)到的多態(tài)性比例最低為E-ACT/MCTT 的62.86%，最高為E-TCC/M-CTT 的93.55%，表明本研究中所采用的熒光AFLP 技術(shù)通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)能夠獲得較大的信息量，這與采用同一方法對(duì)核桃的研究結(jié)果一致[12,14]。同時(shí)，本研究中，AFLP 方法檢測(cè)信息量大、檢測(cè)效率較高，檢測(cè)到的大量多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)于金絲楸種質(zhì)資源的高效、準(zhǔn)確鑒定具有重要參考價(jià)值。另外，對(duì)有效等位基因數(shù)、基因多樣度及Shannon 信息指數(shù)等遺傳多樣性水平表征指標(biāo)進(jìn)行了分析，并與其它樹種或本樹種的以往研究進(jìn)行比較，呈現(xiàn)出不同程度的差異性，這可能是由于樣品的規(guī)模和覆蓋度、采用的方法和算法差異等方面的原因?qū)е碌摹?/p>

楸樹在暖溫帶和亞熱帶范圍內(nèi)廣泛分布，但是由于其野生種群很少且自花不育，加之栽培中以無性繁殖為主，一個(gè)地區(qū)往往只有一個(gè)單一無性系存在[6]，本研究供試75 個(gè)金絲楸無性系之間的遺傳相似系數(shù)為0.742 4～ 0.905 9, 平均值為0.856 8，無性系間的遺傳距離普遍較小，只有JSQ-7、JSQ-8、JSQ-37 和JSQ-63 等4 個(gè)無性系表現(xiàn)出比較顯著的遺傳分化。說明金絲楸無性系間的遺傳基礎(chǔ)較窄、親緣關(guān)系較近。多年生木本植物種內(nèi)較大的遺傳差異對(duì)于雜交育成優(yōu)良品種具有重要意義[23-24]，以4 個(gè)具有顯著遺傳分化的金絲楸無性系作為親本更易于獲得有利變異，可以在今后的金絲楸優(yōu)良新品種選育中加以利用。與種內(nèi)其它類型相比較，金絲楸樹冠狹窄，樹皮呈現(xiàn)塊狀縱裂，枝條短粗，葉片較大、全緣或1～3 淺裂，尤其是木材呈現(xiàn)明顯的特征，其心材呈現(xiàn)黃色，心、邊材交界處金黃色，晚材部分的薄壁細(xì)胞排列呈與髓射線垂直的大波浪狀。本研究聚類分析顯示：光葉楸與灰楸首先聚為一組（遺傳相似系數(shù)為0.649 3），然后與75 個(gè)金絲楸聚在一起，之后再與普通楸樹即‘豫楸1 號(hào)’聚在一起，另一個(gè)近緣種梓樹則與之親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。因此，形態(tài)學(xué)性狀與AFLP 分析結(jié)果均表明金絲楸與普通楸樹存在較明顯的差異，同時(shí)，考慮到本研究中樣品數(shù)量和技術(shù)方法的局限性，在后續(xù)研究中宜擴(kuò)大樣品范圍、采用高通量技術(shù)作更加深入的探討。

4 結(jié)論

本研究以楸樹不同種和類型為對(duì)照在分子水平上分析了金絲楸優(yōu)良無性系的遺傳多樣性水平和親緣關(guān)系, 顯示出金絲楸無性系遺傳背景較狹窄，各無性系的遺傳距離和地理距離呈極顯著正相關(guān)，表明地理隔離對(duì)楸樹遺傳多樣性有明顯的影響。形態(tài)學(xué)性狀觀察和AFLP 分子標(biāo)記分析顯示：金絲楸與普通楸樹存在較顯著的差異性，為金絲楸分類地位的確定和品種鑒定提供了新的證據(jù)，對(duì)于金絲楸優(yōu)良品種的培育具有重要的理論價(jià)值。