基于稀疏偏最小二乘回歸分析白及抗氧化譜效關(guān)系

陳 丹，李紅婷，謝國(guó)勇，秦民堅(jiān)

(中國(guó)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

白及為蘭科植物白及(Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.)的干燥塊莖，其味苦、甘、澀，性微寒，歸肺、肝、胃經(jīng)。除了具有消腫生肌，收斂止血的功效外[1]，白及自古便是美容良藥，被譽(yù)為“美白仙子”。不論是元代《御藥院方》中的七白膏還是現(xiàn)代各類美白護(hù)膚品，白及在美白方面發(fā)揮著重要的作用，而美白的作用機(jī)制之一是通過抗氧化清除機(jī)體代謝產(chǎn)生的自由基[2-3]。因此，研究白及的抗氧化作用對(duì)白及美白原理的探究具有重要意義。據(jù)報(bào)道，白及除了含有糖苷類，還有聯(lián)苯類、聯(lián)芐類、菲類及二氫菲類等化學(xué)成分[4]，這類結(jié)構(gòu)的化合物具有較好的抗氧化效果[5-7]。現(xiàn)有研究中，白及抗氧化的相關(guān)研究較少[8-9]，起抗氧化作用的成分尚不明確。本研究建立12個(gè)批次白及的大孔樹脂有效洗脫段的指紋圖譜，并以稀疏偏最小二乘回歸(Sparse partial least squares regression，SPLSR)方法建立模型，分析其與白及抗氧化的譜效關(guān)系，篩選白及抗氧化有效成分，旨在為白及美白機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(1290型，美國(guó)Agilent公司)，分析天平(MSE，北京賽多利斯天平有限公司)，Q-TOF LC/MS(Agilent 6520，美國(guó)Agilent公司)，數(shù)控超聲波清洗器(KH5200DB，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(QE-100，浙江屹立工貿(mào)有限公司)，高速控溫離心機(jī)(TGL-16M，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，南京科爾儀器設(shè)備有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2010，德國(guó) Merck)，數(shù)字恒溫水浴鍋(HH-S4，金壇市醫(yī)療器械廠)，冷凍干燥機(jī)(LGJ-18S，北京松源華興科技發(fā)展有限公司)，(超)純水系統(tǒng)(NUII-10T，南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司)，酶標(biāo)儀(Epoch，Bio Tek Intsruments公司)，移液槍(10～200 μL/ 100～1000 μL，美國(guó)Thermofisher公司)。

1.2 試驗(yàn)試劑與藥材

無(wú)水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)和乙腈(德國(guó)Merck)均為分析純；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；DPPH(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，純度≥97%)；ABTS(Sigma，純度≥98%)；過硫酸鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99.5%)；維生素C(Vitamin C，VC)(生工生物工程(上海)股份有限公司，純度>99%)；VE(阿拉丁試劑有限公司，純度>96%)；D101大孔樹脂(天津海光化工有限公司)。

12批藥材經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)秦民堅(jiān)教授鑒定，為蘭科植物白及(B.striata)的干燥塊莖。樣品信息如下：

表1 樣品信息Table 1 Information of samples

2 試驗(yàn)方法

2.1 大孔樹脂洗脫方法[10]

取100 g白及打粉，過60目篩，95%乙醇10倍量超聲提取30 min，提取2次，抽濾后合并濾液。50℃旋蒸濃縮至40 mL左右轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，繼續(xù)50℃水浴濃縮至粘稠，最后凍干，得到白及醇提物的干浸膏。取100 g D101大孔樹脂(含水率67.51%)濕法裝柱于3 cm×70 cm層析柱。取3 g浸膏以60 mL無(wú)水乙醇溶解后加入240 mL純水混勻后，以9000 r·min-1，25℃離心30 min，取上清液上樣。以0.005～0.015 BV·min-1的流速反復(fù)吸附5～6次后，關(guān)閥靜置過夜吸附。隨后，用4 倍柱體積(BV)的水、30%、50%、70%、95%乙醇依次洗脫，洗脫流速控制在0.005～0.05 BV·min-1。收集各段洗脫液，50℃旋蒸濃縮至30 mL左右后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿，繼續(xù)50℃水浴濃縮至呈流浸膏狀，隨后冷凍干燥。

2.2 抗氧化試驗(yàn)

2.2.1 樣品溶液的制備

稱定水、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫浸膏以及白及95%醇提物浸膏各5.00 mg，分別用水、30%、50%、70%以及95%乙醇溶解后容量瓶定容至5 mL，搖勻即得1 mg·mL-1樣品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱定5.00 mg VC和VE，分別以純水和95%乙醇溶解、容量瓶定容至5 mL，搖勻即得1 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.2.3 DPPH溶液的制備

稱取1.25 mg DPPH，以無(wú)水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中定容、搖勻得到0.05 mg·mL-1DPPH溶液，溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.4 ABTS+·溶液的制備

稱取19.20 mg ABTS和3.31 mg過硫酸鉀K2S2O8，分別以水溶解，棕色容量瓶定容至5 mL，配成7.00 mmol·L-1ABTS溶液和2.45 mmol·L-1K2S2O8溶液。將二者混合、搖勻，室溫避光靜置12 h，形成綠色的ABTS+·母液。使用前將其用無(wú)水乙醇稀釋30倍，即得ABTS+·溶液。

2.2.5 DPPH清除試驗(yàn)

將樣品溶液稀釋成5個(gè)濃度梯度，分別取50 μL于EP管中，加入250 μL DPPH溶液，搖勻。室溫避光靜置30 min后在517 nm處測(cè)定吸光值3次，取平均值，VC和VE做陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品平行3次試驗(yàn)。根據(jù)不同濃度下的DPPH清除率計(jì)算半抑制濃度IC50。

DPPH·清除率(%)= [1-(A樣品- A空白)/A對(duì)照] × 100%[11]

其中，A樣品為50 μL樣品溶液加入250 μL DPPH溶液避光反應(yīng)30 min后的吸光度，A空白為50 μL樣品溶液加入250 μL DPPH溶劑無(wú)水乙醇避光反應(yīng)30 min后的吸光度，A對(duì)照為50 μL樣品溶劑加入250 μL DPPH溶液避光反應(yīng)30 min后的吸光度。

2.2.6 ABTS 清除試驗(yàn)

將樣品溶液稀釋成5個(gè)濃度梯度，分別取50 μL于EP管中，加入250 μL ABTS+·溶液，搖勻。室溫避光靜置20 min后在752 nm處測(cè)定吸光值3次，取平均值，VC和VE做陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品平行3次試驗(yàn)。根據(jù)不同濃度下的ABTS+·清除率計(jì)算半抑制濃度IC50。

ABTS+·清除率(%)= [1-(A樣品- A空白)/A對(duì)照] × 100%[12]

其中，A樣品為50 μL樣品溶液加入250 μL ABTS+·溶液避光反應(yīng)30 min后的吸光度，A空白為50 μL樣品溶液加入250 μL ABTS+·溶劑無(wú)水乙醇避光反應(yīng)30 min后的吸光度，A對(duì)照為50 μL樣品溶劑加入250 μL ABTS+·溶液避光反應(yīng)30 min后的吸光度。

2.3 HPLC指紋圖譜及MS/MS條件

2.3.1 供試品溶液的制備

精密稱取12批白及大孔樹脂70%乙醇洗脫段的干浸膏各1.00 mg，分別加入70%乙醇溶液溶解并各自定容于1 mL的容量瓶中，得到1 mg·mL-1的溶液，再以0.22 μm的微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

2.3.2 HPLC色譜條件

漢邦C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(B)-水(A)梯度洗脫(0～15 min，18%～30%B；15～20 min，30%～34%B；20～28 min，34%～39%B；28～38 min，39%～45%B；38～42 min，45%～60%B；42～46 min，60%～95%B；46～50 min，95%B)；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1。

2.3.3 MS/MS條件

電噴霧離子化正離子模式；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍100～1000 m/z；霧化氣壓力40 psi；毛細(xì)管壓力4000 V；干燥氣流速10 L·min-1；干燥氣溫度350℃；碰撞壓力25 V；錐孔壓力40 V。

2.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012生成指紋圖譜；R軟件3.6.2進(jìn)行譜效分析建模；Microsoft Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 大孔樹脂分段效果

各段洗脫物對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力如圖1所示。70%乙醇洗脫段對(duì)DPPH(IC50= 126.611 μg·mL-1)和ABTS(IC50= 16.319 μg·mL-1)自由基清除效果在各洗脫段中均為最佳，遠(yuǎn)優(yōu)于樹脂洗脫前的總提物清除效果(DPPH IC50= 2 270.965 μg·mL-1，ABTS IC50= 1 226.480 μg·mL-1)，其清除ABTS自由基的能力甚至優(yōu)于VE(IC50= 26.096 μg·mL-1)，略遜色于VC(IC50= 12.527 μg·mL-1)。

圖1 大孔樹脂不同洗脫段的抗氧化效果Fig. 1 Antioxidant efficiency of different macroporous resin eluent fractions of B. striata

3.2 抗氧化效果

IC50作為評(píng)價(jià)抗氧化效果的指標(biāo)，其值越小，表明清除效果越好。如表2所示，白及12個(gè)批次的70%乙醇洗脫段對(duì)DPPH、ABTS自由基表現(xiàn)出較好的清除效果，尤其是ABTS試驗(yàn)，所有樣品批次的IC50均低于VE，略高于VC。

表2 12批次白及70%乙醇洗脫段DPPH、ABTS清除效果Table 2 DPPH and ABTS scavenging efficiency of 70% ethanol elution fractions of 12 batches of B. striata

3.3 HPLC指紋圖譜

應(yīng)用指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)時(shí)，將樣品S01設(shè)為參照?qǐng)D譜，中位數(shù)生成對(duì)照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1。在經(jīng)過多點(diǎn)校正、全峰匹配、生成對(duì)照R后，得到12批樣品HPLC色譜疊加圖如圖2A所示；共得到27個(gè)共有峰，見圖2B。計(jì)算相似度，結(jié)果如表3所示。12批次白及70%乙醇洗脫段HPLC色譜相似度范圍為0.896～0.996，相似度結(jié)果較好。

最后進(jìn)行方法學(xué)考察，共有峰的峰面積RSD均小于5%，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。

圖2 12批次白及70%乙醇洗脫段指紋圖譜及共有峰Fig. 2 HPLC fingerprint and common peaks of 70%ethanol elution fractions of 12 batches of B. striata注：A. 12批次白及70%乙醇洗脫段指紋圖譜；B. 12批次白及70%乙醇洗脫段共有峰

3.3 譜效分析結(jié)果

以12批次白及70%乙醇洗脫段指紋圖譜的27個(gè)共有峰為自變量，分別以12批次白及70%乙醇洗脫段的DPPH和ABTS的IC50值為因變量進(jìn)行稀疏偏最小二乘回歸建模。

DPPH稀疏偏最小二乘回歸模型為：

Y=-1.588X2-1.857X3-3.463X4-3.445X5+6.583X6-0.387X7-2.861X12-3.446X13-3.258X16-2.131X17-5.016X18+2.070X21+2.041X23-1.680X24-0.297X25

該模型的預(yù)測(cè)精度為

R2=0.991 7，RMSE=1.835 6，RPE=0.015 6

ABTS稀疏偏最小二乘回歸模型為：

Y=-0.473X2+0.194X3+0.433X4+0.464X5+1.568X6-0.143X7-0.700X8-0.176X9-0.163X10-0.591X11-0.296X13-0.383X14-0.282X15-0.046X16-0.084X18-0.212X19-0.874X20-0.079X21+0.181X22-0.155X23+0.700X25+0.203X26-0.466X27

該模型的預(yù)測(cè)精度為：

R2=0.999 9，RMSE=0.004 5，RPE=0.000 2

各峰回歸系數(shù)的絕對(duì)值大小表征對(duì)抗氧化效果的貢獻(xiàn)程度，絕對(duì)值越大，峰的貢獻(xiàn)程度越大。而因變量Y表示的是抗氧化效果的IC50值，所以Y值越小，抗氧化效果越好。故回歸系數(shù)為負(fù)值的峰對(duì)抗氧化效果起促進(jìn)作用，而回歸系數(shù)為正值的峰對(duì)抗氧化效果起抑制作用。在DPPH的稀疏偏最小二乘回歸模型中，X6，X21，X23抑制了DPPH抗氧化效果，其余峰起促進(jìn)作用，促進(jìn)效果依次為X18>X4>X13>X5>X16>X12>X17>X3>X24>X2>X7>X25。在ABTS的稀疏偏最小二乘回歸模型中，X3，X4，X5，X6，X22，X25和X26對(duì)ABTS抗氧化效果起抑制作用，其余峰起促進(jìn)作用，促進(jìn)效果依次為X20>X8>X11>X2>X27>X14>X13>X15>X19>X9>X10>X23>X7>X18>X21>X16。

兩模型的復(fù)測(cè)定系數(shù)R2均大于0.99，表明預(yù)測(cè)效果很好，且均方根誤差RMSE和相對(duì)預(yù)測(cè)誤差RPE的值都較小，說(shuō)明預(yù)測(cè)精度較高。

圖3 白及總離子流圖及色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram and chromatogram of B. striata注：A. 白及總提物總離子流圖；B. 白及總提物色譜圖；C. 白及70%乙醇洗脫段色譜圖

綜合考慮峰的回歸系數(shù)即峰的貢獻(xiàn)程度以及峰面積的大小，選擇對(duì)抗氧化效果影響相對(duì)較大的峰4、8、12、13、15、16進(jìn)行MS/MS初步鑒定，鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 有效峰MS/MS鑒定結(jié)果Table 3 Identification of effective peaks by MS/MS

4 討論

偏最小二乘回歸作為數(shù)據(jù)集探索性分析的有力工具，綜合了多元線性回歸、典型相關(guān)分析和主成分分析這三種分析方法，不僅克服了多自變量多重共線性的問題，還可以在樣本量遠(yuǎn)小于自變量的情況下運(yùn)用[23]。但是PLSR在擬合模型時(shí)會(huì)包含全部變量特征，當(dāng)變量較多時(shí)，模型往往存在大量無(wú)關(guān)變量，使得響應(yīng)變量缺乏解釋能力。SPLSR的提出正是為了解決這一問題。通過在偏最小二乘算法中施加一個(gè)變量選擇的過程，來(lái)扣除無(wú)關(guān)變量，簡(jiǎn)化模型[24]。近年來(lái)，SPLSR在科學(xué)研究中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[25-27]。

在該研究中，白及經(jīng)過大孔樹脂梯度洗脫分成了水、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫段，其中70%乙醇洗脫段的DPPH和ABTS自由基清除效果最好。在此基礎(chǔ)上，獲得12批白及的70%乙醇洗脫段樣品。隨后，將12批樣品進(jìn)行DPPH和ABTS自由基清除試驗(yàn)，并通過HPLC檢測(cè)。12批樣品表現(xiàn)出了較好的抗氧化效果。分別以DPPH和ABTS自由基清除效果為藥效指標(biāo)，以12批樣品生成的指紋圖譜所獲得的27個(gè)共有峰為自變量進(jìn)行譜效分析。在選擇分析方法時(shí)，由于自變量具有嚴(yán)重的相關(guān)性和多重共線性，且自變量個(gè)數(shù)大于樣本量，所以選擇了SPLSR進(jìn)行譜效分析建模。參考郭婷婷[24]的SPLSR代碼擬合出了DPPH和ABTS的藥效模型。模型結(jié)果表明，白及的抗氧化效果不是單一化合物的作用，而是多個(gè)化合物協(xié)同作用的結(jié)果。其不僅僅含有促進(jìn)抗氧化效果的化合物，也含有抑制抗氧化效果的化合物。此外，化合物含量對(duì)抗氧化效果有較大影響，雖然有些化合物的單位值(回歸系數(shù))在影響白及抗氧化效果的排名中可能并不突出，但是含量的優(yōu)勢(shì)也能使其成為主要有效成分，故以DPPH為指標(biāo)時(shí)，峰4、12、13、16為主要藥效峰，以ABTS為指標(biāo)時(shí)，峰8、13、15為主要藥效峰。從回歸方程中可以看出峰2、7、13、16、18為DPPH和ABTS法共有藥效峰，數(shù)量并不多，說(shuō)明白及中清除兩種自由基的化合物有較大差異，白及經(jīng)大孔樹脂洗脫后清除DPPH的效果提高了18倍而清除ABTS的效果卻提高了75倍也從側(cè)面印證了這一點(diǎn)。峰4、8、12、13、15、16經(jīng)MS/MS初步鑒定為L(zhǎng)usianthridin，3,7-二羥基-2,4-二甲氧基菲，3-[(4-羥苯基)甲基]-4-甲氧基-9,10-二氫菲-2,7-二醇，Bletillatin D，Blestrianol A，3,3'-二羥基-2-(4-羥芐基)-5-甲氧基聯(lián)芐，這些化合物屬于菲類，二氫菲類，聯(lián)苯類或聯(lián)芐類，雖然屬于不同類型的化合物，但是他們的結(jié)構(gòu)中均含有苯環(huán)及羥基，故推測(cè)白及的抗氧化作用可能與酚羥基有關(guān)。其中峰13(Bletillatin D)與DPPH和ABTS自由基清除效果均有較好的相關(guān)性，是一個(gè)潛在的抗氧化劑。