呂氏泰勒蟲抗原蛋白PIP的表達(dá)及抗原性分析

楊 璐，王金花，趙建國，黃良圓，韓 謙，廖承紅

(1.海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)動物科技學(xué)院，海南 ?？?570228)

呂氏泰勒蟲(Theilerialuwenshuni)是屬于頂器亞門(Apicomplexa)梨形蟲目，泰勒科(Theileriisae)的一種血液寄生原蟲，以蜱蟲作為傳播媒介，可引起動物感染泰勒蟲病。呂氏泰勒蟲主要感染山羊和綿羊等動物[1]，導(dǎo)致動物出現(xiàn)高熱、貧血、淋巴結(jié)腫大等癥狀，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致動物的死亡，給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前我國發(fā)現(xiàn)的羊泰勒蟲病的病原主要有3種，尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、呂氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲(T.ovis)，雖然致病力依次減弱，但仍然存在潛在的暴發(fā)威脅[3-4]。所以迫切需要研究出能快速檢測診斷和預(yù)防該病的方法，以控制羊泰勒蟲病的傳染。

羊泰勒蟲病的診斷方法一般有血涂片染色鏡檢、分子生物學(xué)技術(shù)及血清學(xué)診斷等[5-7]。其中血清學(xué)檢測具有方便、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，利于疾病的檢測和防控。ELISA是目前應(yīng)用最多的血清學(xué)診斷方法。呂氏泰勒蟲的抗原蛋白，已報道的有裂殖子表面抗原P32[8]、呂氏泰勒蟲表面膜蛋白rTISP[2]，但rTISP蛋白需要在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，抗原蛋白產(chǎn)率較低[9]，且其也可檢測尤氏泰勒蟲，不能特異性的檢測呂氏泰勒蟲，所以本研究以期找到一個可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中大量表達(dá)的抗原蛋白用于呂氏泰勒蟲的檢測及診斷。PIP是呂氏泰勒蟲預(yù)測免疫蛋白[10]，目前并未見該蛋白表達(dá)及抗原性研究的相關(guān)報道。本研究將利用生物信息學(xué)軟件對其抗原性進(jìn)行分析，以pTYB12質(zhì)粒為載體，構(gòu)建羊呂氏泰勒蟲原核表達(dá)質(zhì)粒并表達(dá)，為呂氏泰勒蟲的血清學(xué)診斷及基因工程疫苗的制備提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；T4 DNA Ligase、pMD18-T Vector Cloning Kit，均購自TaKaRa寶生物工程(大連)股份有限公司；FastDigestNdeI、FastDigestXhoI，均購自 Thermo Scientific公司；GreenTaqMix、DH5α Competent Cell，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；pTYB12表達(dá)載體，購自New England BioLabs公司；透析袋MD34，購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜，購自Milliproe公司；Rabbit Anti-Goat IgG H&L(Alexa Fluor?488)，購自Abcam公司。

1.2 基因組及血清 海南黑山羊抗凝全血、呂氏泰勒蟲陽性血清，均由海南大學(xué)病媒生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備及保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1PIP基因的生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)軟件GENSCAN(https://www.genes.mit.edu/GENSCAN.html)分析預(yù)測PIP基因中所含的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目及位置，并用在線分析網(wǎng)站(http://www.detaibio.com/tools/index.php?r=signal-peptide%2Findex)對CDS區(qū)的信號肽的大小及位置進(jìn)行分析。利用Protean軟件分析PIP蛋白預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)、表面可及性、可塑性及B/T淋巴細(xì)胞抗原表位等信息[11]，并且用IEDB Analysis Resourse(http://tools.iedb.org/main)預(yù)測PIP的抗原表位分布情況[12]，結(jié)果與Protean的結(jié)果對比后綜合判斷，為后續(xù)試驗(yàn)研究該蛋白的抗原性提供理論依據(jù)。運(yùn)用在線工具M(jìn)yHits(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motifscan)分析PIP蛋白結(jié)構(gòu)域，TMpred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPREDform.html)在線軟件分析蛋白的跨膜區(qū)[13]，在線工具SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)。ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)軟件預(yù)測PIP的理化性質(zhì)。

1.3.2PIP基因引物合成及擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布的呂氏泰勒蟲PIP基因CDS區(qū)序列(登錄號為EU753118.1)，利用Primer Premier 5.0軟件對PIP基因CDS區(qū)序列設(shè)計1對引物。并分別在上下游引物的5′端引入限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI的酶切位點(diǎn)及其相應(yīng)的保護(hù)堿基，序列如下，下劃線標(biāo)記出了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，上游引物為：PIP-NdeI-F:5′-CCAGGTTGTTGTACAGAATGCTGGTCATATGTTC-AAGGTCCTCGCCTTCTTTGCCTTTG-3′，下游引物為：PIP-XhoI-R:5′-CTGCAGTCACCCGGGCTCGAGTTAC-TTGAAGAACTTGAAGAGGGTAAGAGTGAAGAGGT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

提取羊全血DNA，以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL：2×PapidTaqMaster Mix 25 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/mL)，DNA 2 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 擴(kuò)增30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物做核酸電泳檢測，并將目的條帶做膠回收，基因擴(kuò)增片段大小預(yù)計為516 bp，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 pTYB12-PIP重組表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pTYB12進(jìn)行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，振搖培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切測序鑒定，正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pTYB12-PIP。

將陽性質(zhì)粒pTYB12-PIP轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆振蕩培養(yǎng)，至OD600值為0.5左右時，加入誘導(dǎo)劑IPTG在37 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時間分別為0、2、4、6、18 h和24 h，IPTG的濃度為0.4 mmol/L和0.8 mmol/L，并用含有pTYB12空載的BL21(DE3)菌種37 ℃以0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h為對照組。通過SDS-PAGE電泳檢測，篩選最佳誘導(dǎo)表達(dá)時間和誘導(dǎo)劑濃度。以最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，大量表達(dá)重組蛋白CBP-PIP，超聲破碎提取總蛋白，離心收集上清和沉淀，做SDS-PAGE電泳分析觀察蛋白的表達(dá)情況。

1.5 PIP蛋白包涵體的變性與復(fù)性 由于該蛋白主要表達(dá)于包涵體中，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體破碎沉淀用變性緩沖液在4 ℃溶解變性，然后將溶液移置離心管中4 ℃，15 000g離心30 min。取上清加入MD34的透析袋中，以復(fù)性緩沖液 A、B、C、D及2次E的順序依次在4 ℃條件下透析，每次透析時間不少于3 h，使蛋白復(fù)性[14-15]，離心取上清，最后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測上清中是否含有目的重組蛋白CBP-PIP。上述試劑配方見表1。

表1 蛋白包涵體的變性與復(fù)性緩沖液配方

1.6 Western Blot分析 以破碎后上清、沉淀及去除包涵體上清為樣品，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，在100 V、90 min條件下將蛋白轉(zhuǎn)置PVDF膜上，用超純水洗滌3次，在封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)中室溫封閉2 h。1∶100稀釋血清(包括羊呂氏泰勒蟲陽性血清和陰性血清)4 ℃過夜孵育，TBST(含1%的Tween-20)洗滌3次。二抗為1∶5 000兔抗羊IgG H&L(Alexa Fluor?488)，孵育2 h。洗滌3次后利用掃膜儀通過熒光檢測，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1PIP基因結(jié)構(gòu)及抗原表位預(yù)測 根據(jù)GenBank中的呂氏泰勒蟲PIP基因的全長序列，在線預(yù)測其僅有1個外顯子，位于該基因序列668～1 183位，共516 bp，因此可用DNA作為模板以擴(kuò)增其CDS區(qū)的序列用于蛋白的表達(dá)。CDS區(qū)的信號肽的大小及位置進(jìn)行分析結(jié)果顯示1～17位氨基酸為信號肽。

用MyHits預(yù)測PIP的蛋白結(jié)構(gòu)，顯示在18～41位 為His rich區(qū)，74～95位為亮氨酸拉鏈(LEUCINE ZIPPER)，在其兩端有2個肉豆蔻甲酰化位點(diǎn)位于71～76位和94～99位，另外在125～127有1個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)位于125～127位氨基酸。軟件TMpred預(yù)測發(fā)現(xiàn)其有3個跨膜區(qū)，位于1～19位、88～110位、125～144位氨基酸。ExPASy ProtParam分析其理化性質(zhì)，預(yù)測該蛋白為非溶性蛋白，等電點(diǎn)pI為9.04，分子質(zhì)量為18.89 kDa。SWISS-MODEL同源建模的方法分析該蛋白全長空間結(jié)構(gòu)，得到95～153位氨基酸預(yù)測結(jié)構(gòu)(見中插彩版圖1)，由圖可知109～114位氨基酸為無規(guī)則卷曲，且位于蛋白結(jié)構(gòu)表面，可變性強(qiáng)，是抗原表位的可能片段。

用IEDB Analysis Resourse預(yù)測B淋巴細(xì)胞表面抗原位于41～45位、68～75位和114位氨基酸(見中插彩版圖2)。DNASTAR中Protean的Jameson-wolf法預(yù)測B淋巴細(xì)胞的表面抗原主要位于40～48位、62～64位、67～75位、110～116位、122～129位、147～149位和151～158位。用Gamier-Robson法和Chouer-Robs法分析其二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示主要為α螺旋占87.7%，有β折疊占26.9%，有9個β轉(zhuǎn)角分布均勻占21.1%，無規(guī)則卷曲有5個 位于69位、72～74位、83～84位、125～126位和129～133位。利用Karplus-Schul做可塑性分析，有8個可塑性較好的區(qū)域占20.4%。通過Emini做表面可及性分析，在124～125位、148～149位、153位氨基酸表面可及性較高，占2.9%。并且利用該軟件的AMPHI及Rothbard-Taylor法對T淋巴細(xì)胞抗原表位的分析結(jié)果預(yù)測PIP可能有8個T淋巴細(xì)胞抗原表位，分布于6～8位、31～41位、53～56位、63～68位、82～100位、125～129位、132～139位和145～157位(見中插彩版圖3)。

2.2PIP基因擴(kuò)增 以呂氏泰勒蟲DNA為模板，用PIP基因CDS區(qū)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。進(jìn)行1%核酸凝膠電泳分析的結(jié)果顯示，得到1條500 bp左右的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)計PIP基因大小相符(圖4A)。

2.3 pTYB12-PIP重組表達(dá)載體的構(gòu)建PIP基因PCR膠回收產(chǎn)物與表達(dá)載體pTYB12雙酶切連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切鑒定結(jié)果顯示，雙酶切獲得2個條帶，分別為載體片段和目的片段(圖4B)，表明pTYB12-PIP重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功。

圖4 PIP基因的PCR擴(kuò)增及pTYB12-PIP重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 PIP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 根據(jù)條件摸索選用37 ℃、0.4 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)6 h作為最佳表達(dá)條件(圖5)。通過超聲破碎裂解菌體后低溫高速離心，將上清與沉淀用SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果表明該蛋白主要存在于沉淀中，是一種非可溶性蛋白。將沉淀用7 mol/L鹽酸胍變性后梯度透析復(fù)性，取上清做SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，在上清中純化得到較純的可溶性CBP-PIP重組蛋白(圖6A)。

圖5 重組蛋白CBP-PIP的SDS-PAGE電泳分析

2.5 Western Blot分析 以破碎后上清、沉淀及去除包涵體上清為抗原，進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果表明破碎后上清、沉淀和去包涵體上清中的呂氏泰勒蟲PIP蛋白與呂氏泰勒蟲陽性血清反應(yīng)，在68 kDa 左右處均有陽性條帶(圖6B)。

圖6 重組蛋白CBP-PIP純化結(jié)果及Western Blot分析

3 討論

抗原表位分析表明該蛋白具有一定的抗原性，因β折疊和α螺旋通常位于蛋白質(zhì)內(nèi)部且其結(jié)構(gòu)規(guī)則緊密，一般作為蛋白骨架不具有抗原性，而β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲一般位于蛋白表面，且具有較好的可塑性成為抗原表位的可能性比較大。同理，親水性好的區(qū)域更容易在蛋白表面，故有利于形成抗原表位[11,16-18]。另外，可塑性與表面可及性較好的區(qū)域柔韌性更好，利于抗原與抗體嵌合，有利于抗原表位的形成。綜合以上因素與Protean的Jameson-wolf法及IEDB Analysis Resourse生物信息學(xué)軟件[12]進(jìn)行PIP蛋白B淋巴細(xì)胞抗原表位的分析，表明PIP具有較好的抗原性。SWISS-MODEL預(yù)測的蛋白空間結(jié)構(gòu)時，由于數(shù)據(jù)庫中與PIP同源性片段較少，因此僅獲得PIP蛋白95～153位氨基酸空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果，其中109～114位氨基酸為無規(guī)則卷曲，可變性強(qiáng)，可以推測其成為抗原表位的可能性比較大，這與Protean的Jameson-wolf法的B淋巴細(xì)胞抗原表位的分析結(jié)果一致，增加了結(jié)果的可信度。

本研究成功獲得純化后的可溶性重組蛋白CBP-PIP。免疫原性分析結(jié)果顯示，表達(dá)的 PIP重組蛋白能被呂氏泰勒蟲感染羊的血清所識別，這說明該蛋白對呂氏泰勒蟲陽性血清有較好的抗原性。我們將對其他泰勒蟲和巴貝斯蟲種的陽性血清樣本進(jìn)行檢測以確定其特異性，為下一步利用該蛋白對泰勒蟲病的早期、快速診斷提供理論支持。