結(jié)核分枝桿菌PE_PGRS33蛋白的研究進展

鞠曉紅，王月華，方 芳

PE_PGRS亞家族是分枝桿菌屬細菌特有蛋白，絕大多數(shù)只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，部分可在其他致病性分枝桿菌表達，如海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌等[1]。因其N端有高度保守的脯氨酸-谷氨酸(Proline-Glutamic，PE)基序、C端富含多態(tài)性的鳥嘌呤胞嘧啶重復(fù)序列(polymorphic guanine cytosine rich repeat sequence,PGRS)而得名，是一個功能極其復(fù)雜的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異的多態(tài)性蛋白家族，包括60多個成員。雖然近年來研究證實一些家族成員與結(jié)核分枝桿菌的致病性與毒力密切相關(guān)，在研發(fā)新型疫苗和抗結(jié)核治療方面表現(xiàn)出巨大潛力[2-5]。但迄今為止的多數(shù)研究只集中于少數(shù)幾個成員的結(jié)構(gòu)和功能，大多數(shù)成員在致病性和生物學功能方面的作用仍不清楚。眾多成員中，最具代表性的是PE_PGRS33蛋白，有許多獨特功能，同時也是研究得較為深入的一個成員。本文就將近年來有關(guān)PE_PGRS33的研究進展做一簡要綜述，以期為今后進一步研究該家族蛋白的生物學功能、致病機制及基因調(diào)控機制等提供參考，為利用PE_PGRS蛋白開發(fā)新型疫苗和診斷試劑及治療策略提供依據(jù)。

1 PE_PGRS33蛋白的結(jié)構(gòu)域

PE_PGRS33蛋白由Rv1818c基因編碼，Rv1818c基因位于結(jié)核分枝桿菌H37Rv的2061178～2062674之間，全長1 497 bp，GC含量高達78.16%。編碼的PE_PGRS33蛋白是一種穩(wěn)定的疏水蛋白，位于結(jié)核分枝桿菌細胞壁上，暴露于細胞表面。蛋白全長498個氨基酸，分子量約41 kDa，共有19種氨基酸組成，其中甘氨酸約占41%，丙氨酸約占20%。完整蛋白由3個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別是N端的PE結(jié)構(gòu)域(PE domain)、C端的PGRS結(jié)構(gòu)域(PGRS domain)和連接二者的一段短的連接區(qū)(linker region，LR)，也有學者將其稱為過渡區(qū)(transition domain)或跨膜區(qū)(transmembrane region)(圖1)。但生物信息學預(yù)測顯示[6]，PE_PGRS33蛋白無跨膜螺旋，全部存在于膜外側(cè)。PE結(jié)構(gòu)域含100個氨基酸殘基，高度保守，第8位和第9位是PE家族蛋白的標志性基序Proline-Glutamic(PE)；PGRS結(jié)構(gòu)域含357個氨基酸殘基，富含甘氨酸-丙氨酸重復(fù)序列(GGAGG)，極具多態(tài)性，主要表現(xiàn)在大小、氨基酸序列和重復(fù)片段的數(shù)量上；過渡區(qū)是一段高度保守序列，含41個氨基酸殘基[7]。生物信息學分析，PE_PGRS33蛋白含有5個蘇氨酸磷酸化位點和2個絲氨酸磷酸化位點，有27個B淋巴細胞抗原表位和4個T淋巴細胞抗原表位；結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示蛋白的二級結(jié)構(gòu)有85個α-螺旋、111個β-折疊、52個β-轉(zhuǎn)角和250個無規(guī)則卷曲，結(jié)構(gòu)較為松散[6]。

圖1 PE_PGRS33蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Schematic of PE_PGRS33 protein domains

PE_PGRS33蛋白介導(dǎo)的典型毒力特征依賴于其結(jié)構(gòu)的完整性，三者缺一不可。PE結(jié)構(gòu)域的主要功能有二：一是將蛋白經(jīng)由ESX分泌系統(tǒng)(EAST-6 secretion system,ESX)定向轉(zhuǎn)位至細胞壁，使PGRS結(jié)構(gòu)域暴露于細胞表面；二是提供T淋巴細胞識別表位，激發(fā)細胞免疫應(yīng)答。PGRS結(jié)構(gòu)域的作用多樣而復(fù)雜，是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要功能區(qū)，與致病和免疫逃逸密切相關(guān)。作為細胞表面暴露部分，PGRS結(jié)構(gòu)域首先觸發(fā)天然免疫應(yīng)答，如刺激巨噬細胞釋放細胞因子、誘導(dǎo)細胞凋亡；介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細胞，在細菌的持續(xù)性感染和致病中發(fā)揮作用；包含多個B細胞抗原表位，激發(fā)體液免疫應(yīng)答。兩個結(jié)構(gòu)域之間連接區(qū)的確切功能尚不清楚，有研究顯示可能與細菌進入細胞后PE_PGRS33蛋白定位于宿主細胞線粒體有關(guān)。全長PE_PGRS33基因轉(zhuǎn)染人橫紋肌肉瘤細胞24 h后，染色發(fā)現(xiàn)表達的蛋白定位于細胞線粒體。進一步構(gòu)建不同長度基因片段轉(zhuǎn)染細胞發(fā)現(xiàn)，缺失PE和PGRS結(jié)構(gòu)域之間41個氨基酸連接區(qū)后，蛋白不能在線粒體上定位，說明連接區(qū)是蛋白線粒體定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，推測連接區(qū)可能包含某種特定定位信號或是引導(dǎo)蛋白正確移位和折疊的必須序列[8]。

2 PE_PGRS33蛋白的分泌與定位

2.1分泌途徑 同大多數(shù)PE_PGRS家族成員缺乏典型分泌信號的特征一樣，PE_PGRS33也無蛋白信號肽，然而在細胞質(zhì)中合成的蛋白，最終卻表達于細胞壁表面，說明結(jié)核分枝桿菌能另辟蹊徑將胞內(nèi)合成的PE_PGRS33蛋白轉(zhuǎn)運至細胞表面。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，與PE_PGRS蛋白分泌有關(guān)的是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種新型分泌系統(tǒng)-Ⅶ型分泌系統(tǒng)(type VII secretion systems，T7SS)，也被稱為ESX系統(tǒng)，在結(jié)核分枝桿菌中存在5種ESX，分別命名為ESX-1～ESX-5，參與胞內(nèi)PE_PGRS蛋白分泌的主要是在進化上出現(xiàn)較晚的ESX-5，推測PE_PGRS蛋白可能是ESX-5的特異底物。將攜帶PE_PGRS33基因的質(zhì)粒分別導(dǎo)入海分枝桿菌野生株E11和ESX-5突變株7CI中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESX-5缺失的突變株不能將蛋白轉(zhuǎn)運至細胞表面，從而證實PE_PGRS33也是ESX-5的特異底物[7]。但與結(jié)核分枝桿菌不同的是海分枝桿菌轉(zhuǎn)運到胞壁的PE_PGRS33蛋白分子量明顯降低，推測在海分枝桿菌轉(zhuǎn)運的過程中蛋白可能經(jīng)過加工處理。Burggraaf等[11]研究海分枝桿菌質(zhì)粒表達PE_PGRS蛋白的分泌中發(fā)現(xiàn)，C端具有天冬氨酸蛋白酶活性的PE_PGRS蛋白(如PE_PGRS35)，包含典型的DTG/DSG序列，在運送過程中先被加工裂解，然后再表達在細胞表面。由于海分枝桿菌不天然表達PE_PGRS33蛋白，可能在菌體內(nèi)的運輸處理過程與結(jié)核分枝桿菌存在差異。

2.2亞細胞定位 完整表達的PE_PGRS33蛋白定位于結(jié)核分枝桿菌的細胞壁，PE區(qū)起錨定作用嵌埋在胞壁外膜上，PGRS結(jié)構(gòu)域暴露于細胞表面，負責與宿主細胞相互作用，未發(fā)現(xiàn)分泌至胞外可溶形式存在的蛋白。只有PE結(jié)構(gòu)域而無PGRS結(jié)構(gòu)域的蛋白能在細胞壁上檢測到但不能暴露于細胞外，反之只有PGRS結(jié)構(gòu)域則只能在細胞質(zhì)中檢測到，進一步證實了PE結(jié)構(gòu)域負責將胞質(zhì)內(nèi)合成的PE_PGRS33蛋白轉(zhuǎn)位至細胞壁的功能[7]。侵入巨噬細胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌表達的PE_PGRS33蛋白可能經(jīng)過MHC-Ⅰ類和Ⅱ類途徑經(jīng)過抗原提呈以MHC-肽段的形式表達于感染細胞表面，被T淋巴細胞和B淋巴細胞識別，在特異性細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮作用[12]。

重組恥垢分枝桿菌表達不同長度PE_PGRS33蛋白的結(jié)果顯示，PE結(jié)構(gòu)域全部缺失菌株只能在胞質(zhì)中檢測到不完整PE_PGRS33蛋白，表達全長蛋白的菌株可在胞質(zhì)和胞壁上同時檢測到PE_PGRS33蛋白，在細菌培養(yǎng)上清液中均檢測不到PE_PGRS33蛋白，說明PE_PGRS33不是分泌型蛋白，屬于細胞壁上的結(jié)合蛋白，蛋白的轉(zhuǎn)運信號存在于PE結(jié)構(gòu)域。進一步研究發(fā)現(xiàn)，缺失PE結(jié)構(gòu)域最初30個氨基酸的菌株，蛋白同樣定位于胞質(zhì)中，在胞壁上僅有極少量蛋白表達，提示轉(zhuǎn)位信號存在于蛋白最前端的30個氨基酸中，下游氨基酸維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[7]。目前尚未獲得PE_PGRS33蛋白PE結(jié)構(gòu)域的確切構(gòu)象，研究最為清楚的PE結(jié)構(gòu)域來源于該家族的獨特成員PE25(僅有PE結(jié)構(gòu)域，與其后的PPE41形成異源二聚體)，考慮到PE結(jié)構(gòu)域的高度保守性，推測PE_PGRS33蛋白應(yīng)該具有相似的結(jié)構(gòu)特點。PE25的PE結(jié)構(gòu)域有兩個α-螺旋，分別位于8～37位氨基酸和45～84位氨基酸之間，由38～44之間一段成環(huán)狀的氨基酸連接[13]。結(jié)合PE_PGRS33蛋白缺失N端最初30個氨基酸不能轉(zhuǎn)位到細胞壁上的事實，推測第1個α-螺旋直接參與將蛋白輸送至ESX-5分泌系統(tǒng)并最終將其錨定在細胞壁上，第2個α-螺旋和環(huán)狀連接區(qū)維持完整蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性。

在天然表達PE_PGRS33蛋白的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG)和結(jié)核分枝桿菌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，缺失PE結(jié)構(gòu)域的菌株蛋白主要存在于胞質(zhì)中，但表達完整PE_PGRS33的結(jié)核分枝桿菌，只能在胞壁上檢測到蛋白，不同于恥垢分枝桿菌，說明在野生型菌株胞質(zhì)中合成的蛋白全部轉(zhuǎn)位至細胞壁，不會在胞質(zhì)中積聚。據(jù)此推測，在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群可能存在PE_PGRS33蛋白合成的負反饋調(diào)節(jié)機制，不會合成過量的PE_PGRS33蛋白使其積聚，這也可能是細菌在不同生長環(huán)境和生長階段差異性表達該蛋白的原因之一。

3 PE_PGRS33蛋白的表達與調(diào)控

PE_PGRS33蛋白組成性表達于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，不具有家族其他成員還能表達于海分枝桿菌的特性，是結(jié)核分枝桿菌在進化過程中獲得的一組Rv1818c基因編碼的毒力因子，暴露于細胞表面，在不同生長狀態(tài)下差異性表達，與結(jié)核分枝桿菌的致病性密切相關(guān)，影響著疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸[14-15]。實驗室菌株H37Rv、減毒株BCG、臨床菌株CDC1551和臨床分離株中表達的PE_PGRS33存在明顯多樣性，主要表現(xiàn)為PGRS結(jié)構(gòu)域重復(fù)序列的數(shù)量、氨基酸種類和序列差異，如H37Rv、BCG、CDC1551分別有21、26、32個GGAGG重復(fù)序列。

PE_PGRS33蛋白的表達在轉(zhuǎn)錄水平上受Sigma因子調(diào)控，參與調(diào)控的主要有Sigma A、Sigma B和Sigma D[16]。PE_PGRS33起始密碼為ATG，終止密碼為TAG，5′-RACE分析顯示，轉(zhuǎn)錄起始點位于PE結(jié)構(gòu)域上游5′端距ATG 75個核苷酸處，轉(zhuǎn)錄起始位點上游7個核苷酸位置有典型的-10區(qū)序列(TACGCT)，未發(fā)現(xiàn)-35區(qū)序列，在假定的-35區(qū)附近出現(xiàn)一個多聚A拉伸(poly-A stretch)。轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，Sigma A識別PE_PGRS33蛋白的啟動子，促進基因表達。在啟動子區(qū)還存在一個操縱序列，能被誘導(dǎo)阻遏蛋白識別，在應(yīng)激條件下參與蛋白的表達調(diào)節(jié)，如當結(jié)核分枝桿菌進入巨噬細胞內(nèi)或暴露于營養(yǎng)匱乏及低氧等不利環(huán)境時，阻遏蛋白通過某種途徑被誘導(dǎo)表達，下調(diào)PE_PGRS33的轉(zhuǎn)錄水平。Sigma B促進基因表達，在Sigma B過表達菌株，PE_PGRS33表達顯著增加。Sigma D可能通過直接或間接驅(qū)動誘導(dǎo)性阻遏蛋白表達，從而抑制PE_PGRS33表達，在Sigma D突變株P(guān)E_PGRS33表達明顯上調(diào)。SigmaD在穩(wěn)定生長期和營養(yǎng)缺乏時表達上調(diào)，PE_PGRS33與之正好相反。但低氧環(huán)境時，二者均表達下調(diào)，說明在結(jié)核分枝桿菌中還存在其他的調(diào)控機制，需要進一步深入探討。

4 PE_PGRS33蛋白的變異

PE_PGRS33蛋白在基因水平存在廣泛變異，是結(jié)核分枝桿菌抗原變異的重要原因。以堿基的插入、刪除和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)為主，突變主要集中于PGRS結(jié)構(gòu)域，所有插入序列均位于PGRS結(jié)構(gòu)域，影響到1至多個重復(fù)序列，移碼突變只有1個，余者均為非移碼突變[17-18]，說明在菌體內(nèi)存在選擇壓力來維持基因開放讀碼框的穩(wěn)定性，據(jù)此可以推測PE_PGRS33蛋白在結(jié)核分枝桿菌生存中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。突變集中于PGRS結(jié)構(gòu)域的原因可能是在重復(fù)序列的復(fù)制和重組過程中，發(fā)生滑鏈錯配(replicationslippage)。Camassa等[18]研究135株臨床菌株發(fā)現(xiàn)，PE_PGRS33基因變異的dN/dS為0.64，屬于純化突變，進一步證實PE_PGRS33的基因多態(tài)性可能損害結(jié)核分枝桿菌的重要功能，因此菌體內(nèi)存在負向選擇壓力，對抗有害突變。插入堿基范圍9～270 bp，均為非移碼突變；刪除堿基大小在1～363 bp之間，唯一發(fā)生的移碼突變是在1 014 bp處刪除1bp(-1 bp)，刪除后基因繼續(xù)編碼36個氨基酸后提早出現(xiàn)終止密碼，丟失后續(xù)C端的160個氨基酸，其中包含12個重復(fù)序列。發(fā)生-1bp突變的菌株毒力明顯降低，可能與C末端258 bp保守序列丟失有關(guān)。突變頻率最高的位點是717 bp處發(fā)生TC的同義突變；其次是1 240 bp處插入9 bp，增加1個甘氨酸-丙氨酸重復(fù)序列，二者同時突變占25.4%[19]。移碼突變和大片段的非移碼突變損害結(jié)核分枝桿菌侵入人類巨噬細胞能力，但不影響細菌在胞內(nèi)的生存繁殖和蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用，可能是結(jié)核分枝桿菌持續(xù)性感染階段發(fā)生組織損傷和成人肺結(jié)核缺乏空洞的主要原因。值得注意的是，在兒童和肺外結(jié)核病中，PE_PGRS33基因的多態(tài)性不影響結(jié)核分枝桿菌毒性，但能限制細菌的高效傳播[18]。

臨床菌株P(guān)E結(jié)構(gòu)域基因突變以SNP為主，同義和非同義突變各占50%，在131～133 bp處發(fā)現(xiàn)1個刪除突變[19]。結(jié)構(gòu)域的功能研究中發(fā)現(xiàn)[7]，PE結(jié)構(gòu)域N端的2、3位氨基酸發(fā)生SF→AA(絲氨酸苯丙氨酸→丙氨酸丙氨酸)變異和8、9氨基酸發(fā)生PE→AA(脯氨酸谷氨酸→丙氨酸丙氨酸)變異后，不影響PE_PGRS33蛋白表型，但蛋白在細胞壁表達的穩(wěn)定性明顯降低。推測可能的原因有二：一是這兩個部位的氨基酸參與PE結(jié)構(gòu)域的錨定功能，變異后錨定不牢固致使胞壁蛋白不穩(wěn)定；二是變異后可能改變了PE_PGRS33蛋白的二級結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象，進而影響了蛋白的穩(wěn)定性。

分析上述PE_PGRS33蛋白的變異特征不難發(fā)現(xiàn)，在多種類型的變異中對結(jié)核分枝桿菌影響最大的是1 014 bp處發(fā)生的移碼突變，其次是1 240 bp處的插入突變，雖然不同程度影響了結(jié)核分枝桿菌的毒力和入侵宿主細胞的能力，但對細菌生存能力影響甚微，結(jié)合dN/dS小于1(0.64)的研究結(jié)果，證實在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)存在負向選擇壓力，迫使其發(fā)生純化突變，印證了PE_PGRS33蛋白對于維持結(jié)核分枝桿菌功能的重要價值。進一步需要深入探討的是臨床分離菌株P(guān)E_PGRS33基因發(fā)生不同變異后，對細菌與巨噬細胞的相互作用及逃避宿主免疫防御能力的影響，明確基因多態(tài)性與臨床表型的關(guān)系，作為今后研究其在臨床菌株中功能差異的基礎(chǔ)。

5 PE_PGRS33蛋白的致病機制

PE_PGRS33蛋白的致病機制主要是通過調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)逃避殺傷，為細菌生存贏得空間和時間、加重組織細胞損傷、促進細菌擴散。PE_PGRS33蛋白發(fā)揮作用的關(guān)鍵是依賴PGRS結(jié)構(gòu)域直接與巨噬細胞表面的Toll 樣受體2(Toll-like receptors 2，TLR-2)結(jié)合，通過TLR-2誘導(dǎo)細菌入侵細胞、活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor,NF-κB)轉(zhuǎn)錄釋放多種炎性細胞介質(zhì)，并能定位宿主細胞線粒體誘導(dǎo)細胞凋亡(圖2)。細菌侵入細胞后，PE_PGRS33蛋白能抑制吞噬溶酶體形成、提升結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)存活能力，與結(jié)核病的持續(xù)性感染有關(guān)。

圖2 PE_PGRS33蛋白致病機制示意圖Fig.2 Schematic of PE_PGRS33 protein pathogenesis

5.1介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細胞 非致病的恥垢分枝桿菌重組表達PE_PGRS33后表現(xiàn)出結(jié)核分枝桿菌的典型毒力特征，能侵入巨噬細胞，在巨噬細胞和宿主組織中的存活能力明顯增強。Rv1818c基因發(fā)生轉(zhuǎn)座子Tn5367插入突變的菌株，在液體培養(yǎng)基失去聚集生長的能力呈分散生長，侵入巨噬細胞和胞內(nèi)存活能力下降，回補完整Rv1818c基因后回復(fù)野生型的毒力特征。PE_PGRS33基因缺失株(Mtb-Δ33)和只表達PE結(jié)構(gòu)域的菌株，進入巨噬細胞的能力顯著下降，主要存在于細胞外，但侵入上皮細胞的能力不受影響[18]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TLR-2缺失小鼠用表達PE_PGRS33的恥垢分枝桿菌感染后，細菌亦不能進入巨噬細胞，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factors α,TNF-α)的釋放水平極低，由此說明暴露于結(jié)核分枝桿菌表面的PE_PGRS33蛋白主要借助PGRS結(jié)構(gòu)域與巨噬細胞表面的TLR-2特異結(jié)合[20-21]。推測PE_PGRS33介導(dǎo)細菌侵入巨噬細胞可能的機制有兩個：一是PE_PGRS33蛋白可能類似于病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMP)，能被巨噬細胞的模式識別受體(patern recognition receptor,PRR)TLR識別，促進內(nèi)化；二是結(jié)核分枝桿菌表面成分復(fù)雜，有脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖及其他非蛋白成分，PE_PGRS33蛋白與這些表面成分相互作用，形成適合細菌黏附的空間構(gòu)象，增強結(jié)核分枝桿菌的黏附能力，促進細菌侵入。另外，TLR-2介導(dǎo)的細菌內(nèi)吞與Ca2+濃度亦密切相關(guān)，PE_PGRS家族普遍存在鈣結(jié)合基序蛋白，與Ca2+高親和，當Ca2+濃度耗盡時，PE_PGRS與TLR-2親和力顯著降低[22-23]。

5.2誘導(dǎo)細胞凋亡 細胞死亡的形式有3種：凋亡、自噬和壞死。PE_PGRS家族不同成員誘導(dǎo)細胞死亡的方式不同，同一種死亡方式誘導(dǎo)途徑亦不相同[24]。PE_PGRS33誘導(dǎo)的細胞死亡以凋亡為主，主要途徑是TLR-2依賴的刺激TNF-α釋放。至于能否誘導(dǎo)細胞壞死目前尚存分歧，有待深入研究。

可溶性的純化PE_PGRS33和表達于細胞壁表面的PE_PGRS33可同樣誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡。刺激TNF-α分泌是PE_PGRS33誘導(dǎo)細胞凋亡的關(guān)鍵，如事先用TNF-α抗體處理細胞，則細胞不發(fā)生凋亡。PE_PGRS33介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細胞和刺激細胞釋放TNF-α的能力均依賴TLR-2[21]。PGRS結(jié)構(gòu)域與TLR-2特異結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TNF-α基因表達，刺激TNF-α分泌，同時誘導(dǎo)細胞表達腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)，TNF-α與TNFR1結(jié)合觸發(fā)死亡信號級聯(lián)反應(yīng)。刪除PGRS結(jié)構(gòu)域后，不能刺激TNF-α釋放。通過構(gòu)建PGRS結(jié)構(gòu)域不同基因片段缺失變異體回補Mtb-Δ33發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細胞的關(guān)鍵序列位于N端140～260個氨基酸之間，該片段的許多疏水區(qū)存在短的親水片段插入，可能是TLR-2的結(jié)合位點[21]。誘導(dǎo)TNF-α釋放的信號通路為TLR-2依賴的凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apotosis signal-regulating kinase 1,ASK1)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路。TLR-2與PE_PGRS33的PGRS結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，激活下游MAP3K家族的ASK1，活化的ASK1繼而激活MAPK家族的p38蛋白和c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)，通過一系列磷酸化反應(yīng)促使NF-κB活化，最終觸發(fā)包括TNF-α在內(nèi)的多種細胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄、釋放。在此過程中，ASK1是p38蛋白和JNK活化的關(guān)鍵。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)信號抑制劑不能影響TNF-α釋放，p38蛋白和JNK抑制劑均能顯著降低TNF-α的釋放，證實PE_PGRS33刺激TNF-α釋放依賴于p38蛋白和JNK信號通路。小鼠和人類巨噬細胞對PE_PGRS33蛋白的反應(yīng)有所不同，可能與TLR-2可變區(qū)在小鼠和人類存在多態(tài)性有關(guān)。

結(jié)核分枝桿菌表達的PE_PGRS 33蛋白具有定位線粒體的能力，侵入細胞后通過線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡[26-27]。目前研究未發(fā)現(xiàn)PE_PGRS33蛋白有線粒體靶向序列(mitochondrial targeting sequence,MTS)，蛋白主要依賴連接區(qū)將PGRS結(jié)構(gòu)域定位于線粒體。與PE_PGRS 33蛋白有55%同源性的PE_PGRS 1不能定位線粒體，提示PE_PGRS 33的PGRS結(jié)構(gòu)域結(jié)合線粒體是特異的，但還不清楚結(jié)核分枝桿菌將蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體上的確切路徑以及信號傳導(dǎo)的具體機制，推測可能通過吞噬逃逸進入胞質(zhì)或通過某個分泌系統(tǒng)與線粒體相互作用的結(jié)果，也可能與TLR-2介導(dǎo)的內(nèi)吞有關(guān)[27]。PE_PGRS 33定位于轉(zhuǎn)染或感染的哺乳動物真核細胞線粒體后，檢測發(fā)現(xiàn)細胞存活率明顯下降，凋亡和壞死細胞顯著增高，其中以凋亡為主。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，PE_PGRS 33誘導(dǎo)后細胞Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(fas-associated death domain,FADD) 蛋白和半胱氨酸蛋白酶(caspase)表達上調(diào)，提示線粒體可能通過死亡受體途徑或caspase8、9、3的依次活化，釋放凋亡信號誘導(dǎo)凋亡[8]。廣譜caspase 抑制劑ZVAD-FMK、caspase 8抑制劑均能阻斷PE_PGRS 33誘導(dǎo)的細胞凋亡。值得注意的是，缺失PE結(jié)構(gòu)域或替換成家族其他蛋白的PE結(jié)構(gòu)域，雖然在線粒體上也能檢測到蛋白表達，但不能誘導(dǎo)明顯的細胞壞死，說明PE結(jié)構(gòu)域在線粒體介導(dǎo)的細胞壞死中發(fā)揮重要作用。 另有研究顯示[24]，PE_PGRS 33蛋白定位人巨噬細胞線粒體后誘導(dǎo)線粒體融合，但不影響鈣離子吸收、活性氧釋放和線粒體膜電位。作為線粒體融合蛋白，PE_PGRS 33應(yīng)該正調(diào)控機體的天然抗菌免疫，但上述實驗結(jié)果說明PE_PGRS 33可能通過調(diào)控某種信號通路抑制宿主的天然免疫應(yīng)答，具體機制有待研究。

5.3抑制細胞免疫應(yīng)答 結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，主要保護作用來源于細胞免疫，PE_PGRS33蛋白的T淋巴細胞抗原表位主要存在于PE結(jié)構(gòu)域，刺激細胞免疫應(yīng)答。PGRS結(jié)構(gòu)域的重復(fù)序列與EB病毒(Epstern Barr virus,EBV)富含甘氨酸和丙氨酸序列的核抗原1(EBV nuclear antigen EBNA-1)具有明顯同源性，推測可能有類似于EBNA-1的作用，阻止PE結(jié)構(gòu)域的抗原加工提呈，通過抑制細胞免疫應(yīng)答逃避宿主的免疫殺傷，提升細菌胞內(nèi)存活能力，在結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染(latent tuberculosis infected,LTBI)中發(fā)揮作用。此外，有研究顯示PE_PGRS蛋白家族存在無序結(jié)構(gòu)區(qū)和無序蛋白，在與宿主的相互作用中發(fā)生從無序到有序的結(jié)構(gòu)改變，從而影響宿主的免疫應(yīng)答[28]。PE_PGRS33蛋白是否也具有此種特性尚不清楚，需深入探討。

6 PE_PGRS33蛋白的應(yīng)用

PE_PGRS33的PGRS結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌與宿主細胞相互作用的主要區(qū)域，在結(jié)核的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，拮抗該結(jié)構(gòu)域的功能可能是抗結(jié)核病治療的新方向。PE結(jié)構(gòu)域具有靶向轉(zhuǎn)位胞內(nèi)蛋白的功能，是構(gòu)建重組DNA疫苗的理想載體。

用重組純化的PE_PGRS33蛋白免疫小鼠后，可在血清中檢測到特異性抗體IgG，與其他結(jié)核分枝桿菌蛋白無交叉反應(yīng)，再次感染時可中和PE_PGRS33的促炎活性、抑制細菌侵入巨噬細胞。因此，通過檢測PE_PGRS33蛋白特異的IgG抗體可用于結(jié)核病的快速診斷；利用特異性抗PE_PGRS33抗體可拮抗細菌與巨噬細胞相互作用的特性，可通過重組純化蛋白制備特異性抗體用于結(jié)核病的免疫學治療[29]。此外，基于PE結(jié)構(gòu)域能將C端蛋白靶向轉(zhuǎn)位至細胞壁的特點，可將PE結(jié)構(gòu)域作為轉(zhuǎn)運工具，在其C末端融合保護性抗原MPT64，構(gòu)建重組BCG疫苗(rBCG)。rBCG通過PE將MPT64輸送至細胞表面，使其成為表面暴露抗原[30]。與BCG相比，接受rBCG免疫的小鼠感染結(jié)核分枝桿菌后，肺和脾中細菌數(shù)量明顯減少(P<0.05)，特異性CD4+T細胞和CD8+T細胞及釋放IFN-γ水平均明顯增加。由此可見，PE_PGRS33可作為對抗結(jié)核分枝桿菌感染的體液免疫的中和靶點或血清學檢測的良好指標，亦可作為理想的候選疫苗加以研發(fā)。

7 問題與展望

PE_PGRS33蛋白由于其復(fù)雜的生物學功能及強大的免疫調(diào)節(jié)作用，近年來成為結(jié)核分枝桿菌研究領(lǐng)域廣為關(guān)注的熱點。PE結(jié)構(gòu)域靶向轉(zhuǎn)位胞內(nèi)蛋白的特性為開發(fā)高效疫苗提供了新方向，PGRS結(jié)構(gòu)域的毒性和特異體液免疫特性為結(jié)核分枝桿菌的治療和診斷提供了新靶點。然而，關(guān)于PE_PGRS33蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡的信號通路、基因表達的調(diào)控及與其他蛋白相互作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)至今尚未闡明，能高效誘導(dǎo)免疫保護作用的抗原表位有待明確，蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)目前是生物信息學分析結(jié)果，真正的空間構(gòu)象尚未闡明。尋找PE_PGRS33蛋白的保護性和特異性抗原表位、明確決定其毒力的關(guān)鍵序列，是開發(fā)疫苗和開展免疫學治療對抗結(jié)核分枝桿菌耐藥性的重要手段，也是未來需重點關(guān)注的研究方向。

利益沖突：無