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    新型冠狀病毒血清特異性抗體檢測(cè)的假性問(wèn)題分析和對(duì)策探討

    2020-12-08 17:35:06寧明哲陶月陳雨欣南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科南京210008
    關(guān)鍵詞:膠體金抗原陰性

    寧明哲,陶月,陳雨欣,柏 兵(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京210008)

    2019年底發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)迅速席卷全球,已成為全球的公共衛(wèi)生大事件,對(duì)全球各地區(qū)人民的生命健康和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大損失。新型冠狀病毒感染導(dǎo)致的疾病稱為新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19),據(jù)世界衛(wèi)生組織的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),截止2020年7月4日,全球COVID-19 確診病例達(dá)1 130 多萬(wàn)例,死亡人數(shù)超過(guò)52 萬(wàn)。目前,我國(guó)的防控防疫工作已取得階段性成果,COVID-19 抗體檢測(cè)是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的主要方法。同時(shí),國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)2020年3月3日發(fā)布的“新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)”,已明確將 COVID-19 IgM 和IgG 抗體作為臨床確診標(biāo)準(zhǔn)[1]。然而,在4月份國(guó)家藥品監(jiān)督管理局也提出抗體檢測(cè)試劑僅用作對(duì)SARSCoV-2 核酸檢測(cè)陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測(cè)[2-5],或在疑似病例診斷中與核酸檢測(cè)協(xié)同使用,不作為SARS-CoV-2 感染者確診和排除的依據(jù),也不適用于一般人群的篩查。這提示現(xiàn)有SARS-CoV-2 抗體檢測(cè)試劑使用過(guò)程中可能存在一定的假陰性和假陽(yáng)性情況。

    目前被國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的COVID-19抗體檢測(cè)試劑盒廠家有廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)股份有限公司 、唐山英諾特生物技術(shù)有限公司、博奧賽斯(重慶)生物科技有限公司、廈門萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司 、珠海麗珠試劑股份有限公司、珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司、上海芯超生物科技有限公司、南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司、博奧賽斯(重慶)生物科技有限公司、廣東和信健康科技有限公司與丹娜(天津)生物科技有限公司。上述檢測(cè)試劑盒主要檢測(cè)SARS-CoV-2 特異性的IgM 和IgG 抗體,檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法,包被的抗原包括SARS-CoV-2的N蛋白(Nucleoprotein)、M蛋白(Membrane protein)和S 蛋白(Spike glycoprotein)。需要提出的是,本次流行的SARS-CoV-2 與曾經(jīng)流行的Bat-SL-CoV,SARS-CoV 與MERS-CoV相比,N,M和S 蛋白在氨基酸序列上具有極高的相似性(90%左右)[6]。這是檢測(cè)方法中的抗原設(shè)計(jì)及結(jié)果判斷應(yīng)當(dāng)考慮的因素。除此之外,COVID-19 的基因末端多出一個(gè)新的ORF10 基因,表達(dá)38 個(gè)氨基酸。用它作為抗原表位,可極大保證COVID-19 抗體檢測(cè)的特異性,但目前的相關(guān)研究和應(yīng)用很少。

    由于包被抗原選擇的復(fù)雜性、高質(zhì)量抗體制備的困難性以及免疫學(xué)檢測(cè)方法本身的局限性,敏感度高、特異度強(qiáng)的試劑盒需要通過(guò)嚴(yán)格的性能驗(yàn)證。由于疫情的迫切性,上述在極短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出的COVID-19 抗體檢測(cè)試劑盒,雖然總體性能尚可,但也出現(xiàn)了一些檢驗(yàn)結(jié)果與臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征不相符的現(xiàn)象。現(xiàn)對(duì)它們進(jìn)行初步探討,并提供一些應(yīng)對(duì)思路。

    1 COVID-19 抗體檢測(cè)中的假陽(yáng)性問(wèn)題

    1.1 既往冠狀病毒感染 COVID-19 屬于β 家族的冠狀病毒[7]。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù),β 家族冠狀病毒該家族中有六種、173 個(gè)病毒。COVID-19 中的N 蛋白、P 蛋白、S 蛋白在氨基酸序列上除與非典型性肺炎病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV)和中東呼吸綜合征病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV) 有高達(dá)90%以上的相似度外,還有多種其它冠狀病毒在基因序列比對(duì)中顯示有類似氨基酸序列。這些病毒多數(shù)不致病,但因?yàn)橛蓄愃菩蛄校梢栽谌梭w內(nèi)產(chǎn)生干擾性抗體,從而導(dǎo)致COVID-19 抗體檢測(cè)的假陽(yáng)性問(wèn)題。該種情況一般導(dǎo)致IgG 抗體假陽(yáng)性,但不排除IgM 假陽(yáng)性。

    1.2 交叉抗體的存在 人體正常情況下含有1011(1 000 億)個(gè)B 細(xì)胞,至少可結(jié)合1 000 萬(wàn)種不同抗原表位以上的抗體[8]。而正常機(jī)體每天產(chǎn)生109個(gè)新的B 細(xì)胞。如此龐大的表位結(jié)合多樣性,完全有可能隨機(jī)產(chǎn)生能與包被在檢測(cè)載體中的抗原片段結(jié)合的抗體。另外,人體在環(huán)境中可受到近1 400 種病原體感染,或接受各種致敏原的刺激,會(huì)產(chǎn)生更多新的抗體,極大增加了不同人體間抗體庫(kù)構(gòu)成的復(fù)雜性,使得干擾抗體可以隨機(jī)存在。這種情況下的假陽(yáng)性,應(yīng)僅IgG 抗體或IgM 抗體陽(yáng)性[10]。

    1.3 高濃度弱親和力的抗體或蛋白干擾 根據(jù)抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)公式([Ab]+[Ag]=[Ag-Ab])及解離常數(shù)Kd=[Ab]*[Ag]/[Ag-Ab]。Kd 越大,親和力越小。一般鼠單抗的親和力在1nmol/L 左右(10-9mol/L),兔單抗的親和力在0.01nmol/L 左右(10-10mol/L)。人體正常血清中IgM 總濃度約為1mg/ml,針對(duì)某一表位的抗體IgM 濃度估計(jì)在總IgM 濃度的萬(wàn)分之一以下,因此其有效濃度不超過(guò)1nmol/L。在抗原為10nmol/L(約1 μg/ml)和Kd 為1nmol/L 的情況下,1nmol/L 的IgM 將與9%的抗原結(jié)合。當(dāng)Kd 降低1 000 倍(1 000nmol/L)時(shí),僅有0.1%的抗原被結(jié)合,導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)將降低100 倍。然而,當(dāng)這種低親和力的抗體濃度1 000 倍增高時(shí)(1 000nmol/L),近50%的抗原被結(jié)合。而這種親和力高濃度的雜質(zhì)分子在血液中經(jīng)常存在。比如,一般細(xì)胞因子的濃度在1ng/ml 左右,而清蛋白在50mg/ml 左右,有著千萬(wàn)倍數(shù)的差異,可對(duì)檢測(cè)造成干擾。

    1.4 方法學(xué)本身的問(wèn)題 特別是膠體金免疫層析法。這種方法方便快捷、便于床邊診斷,但檢測(cè)過(guò)程中沒(méi)有充分的清洗過(guò)程,難以有效去除非特異性結(jié)合物質(zhì)。這種情況下,可用緩沖液手工充分洗滌。真陽(yáng)性的結(jié)果,一般不受洗滌明顯影響。

    1.5 其它常見(jiàn)因素的干擾 如類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF)[9]、補(bǔ)體、嗜異性抗體、溶菌酶等。

    2 COVID-19 抗體檢測(cè)中的假陰性問(wèn)題

    2.1 檢測(cè)試劑中的抗原設(shè)計(jì)與制備 這些抗原蛋白的制備一般采用肽段合成或在質(zhì)粒表達(dá)的方法。合成的肽段和在大腸埃希菌中所表達(dá)的肽段沒(méi)有人體中正常情況下的翻譯后修飾(post-translational modification)。在真核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白的翻譯和修飾是否與COVID-19 所感染的肺泡上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的修飾相同尚不清楚。比如SARS-CoV 的S 蛋白有高達(dá)23 個(gè)糖基化位點(diǎn)和7 個(gè)二硫鍵。這些被修飾的位點(diǎn)對(duì)線性和空間抗原表位有著決定性作用,在合成或重組表達(dá)的抗原中未必完全存在,這樣就可能導(dǎo)致檢測(cè)的假陽(yáng)性。

    2.2 雙抗原夾心法容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果 這種方法需要兩個(gè)抗原與抗體特異性反應(yīng)同時(shí)存在。前已述及,由于抗原抗體反應(yīng)的平衡性及Kd 常數(shù),抗原與抗體并非100%結(jié)合。假如只有70%結(jié)合時(shí),兩者同時(shí)結(jié)合,以形成最終的有效被檢測(cè)物時(shí),只有近一半(49%)。雙抗原夾心法檢測(cè)抗體的另一個(gè)缺點(diǎn)是空間位阻問(wèn)題。包被抗原與標(biāo)記抗原在待測(cè)血清標(biāo)本中并非游離存在。因?yàn)檠宓牡鞍诐舛葮O高(50~70 μg/μl),蛋白容易相互附著。一個(gè)抗體雙臂上抗原結(jié)合區(qū)域之間的空間較小。當(dāng)包被抗原與標(biāo)記抗原與待測(cè)血清中的蛋白有相互附著時(shí),會(huì)因?yàn)榭臻g位阻的原因而影響其與待測(cè)抗體的結(jié)合,而造成檢測(cè)的假陰性。

    2.3 試紙條的膠體金免疫層析法更易產(chǎn)生假陰性結(jié)果 相對(duì)于其它常規(guī)免疫學(xué)檢測(cè)方法中30 min 左右的抗原抗體結(jié)合時(shí)間,膠體金試紙條法的反應(yīng)時(shí)間一般在1 min 內(nèi)完成,抗原抗體可能無(wú)法充分混勻及反應(yīng),造成假陰性的結(jié)果,而且陽(yáng)性結(jié)果的線性定量關(guān)系較差。另外,在膠體金試紙條檢測(cè)COVID-19 抗體的方法中,抗原包被膜條,膠體金標(biāo)記抗人IgM 或IgG。在人血清標(biāo)本中IgM 和IgG的含量極高,而真正待測(cè)抗體的濃度應(yīng)該在萬(wàn)分之一以下,而膠體金標(biāo)記的二抗與血清標(biāo)本中如此高濃度的IgM 或IgG 完全結(jié)合,導(dǎo)致因靈敏度不足而出現(xiàn)的檢測(cè)假陰性。

    2.4 其它導(dǎo)致檢測(cè)假陰性的常見(jiàn)問(wèn)題 如基質(zhì)干擾、鉤狀反應(yīng)等。

    3 COVID-19 抗體檢測(cè)問(wèn)題的解決思路

    3.1 同時(shí)檢測(cè)針對(duì)SARS-CoV-2 的IgM 和IgG 抗體[10-11],在接觸感染源后的第一個(gè)星期左右,IgM和IgG 可同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性。同時(shí)檢測(cè)針對(duì)SARSCoV-2 的IgM 和IgG 抗體可提高敏感度。

    3.2 動(dòng)態(tài)檢測(cè)SARS-CoV-2 的IgM 和IgG 抗體感染初期,第一次抗體檢測(cè)陽(yáng)性時(shí),在3~7 天后再次檢測(cè),IgM 和IgG 水平一般都出現(xiàn)4 倍升高。

    3.3 建議用不同蛋白(如聯(lián)用N 蛋白和S 蛋白)或不同序列的肽段作為包被抗原的試劑盒,進(jìn)行復(fù)查。如為假陽(yáng)性,兩者同時(shí)陽(yáng)性的可能性較小。

    3.4 對(duì)金標(biāo)試紙條可能存在的假陽(yáng)性,可考慮用磷酸鹽(PBS)緩沖液洗滌震蕩3~5 次;對(duì)金標(biāo)試紙條的假陰性,可考慮將前端含有膠體金的墊片取下,先將試紙條插入血清中進(jìn)行充分層析。然后將膜條移入新的濾紙,并在洗脫的膠體金中進(jìn)行層析。

    3.5 對(duì)于非特異性蛋白吸附造成空間位阻的問(wèn)題,可在樣本中加入較強(qiáng)的去垢劑。一般免疫學(xué)檢測(cè)方法中所用的緩沖液僅含0.05%的吐溫-20,不足以去除較強(qiáng)干擾蛋白的吸附。此時(shí)可考慮選擇1%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),甚至RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)緩沖液。這可適用于膠體金試紙條法,但不適用于抗原或抗體被動(dòng)吸附于固相載體上的免疫學(xué)方法。

    3.6 懷疑為類風(fēng)濕因子(RF)等干擾時(shí),可直接檢測(cè)RF水平;當(dāng)RF水平較高時(shí),可考慮為RF水平的干擾。

    4 結(jié)論

    血清新型冠狀病毒特異性的抗體檢測(cè)是對(duì)疑似新型冠狀病毒患者的補(bǔ)充檢測(cè)。但是如果將抗體檢測(cè)應(yīng)用于臨床大規(guī)模檢測(cè)時(shí),則需要考慮潛在檢測(cè)假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題,本文也提出了一些解決思路。相信隨著對(duì)SARS-CoV-2研究的深入,抗體檢測(cè)方法和檢測(cè)性能會(huì)愈發(fā)完善,從而有可能用于大規(guī)模人群的篩查和診斷中,以更好地幫助臨床診斷和流行病的回顧性研究。

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