一個(gè)多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2A家系的臨床特征與基因突變分析

林小云，戚露月,2*，章振林，岳 華

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨質(zhì)疏松和骨病科 上海市骨疾病臨床研究中心，上海 200233；2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，蘇州 江蘇 215004）

多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型 （multiple endocrine neoplasia 2,MEN2）為常染色體顯性遺傳性疾病，其由Sipple[1]在1961年首先報(bào)道，故又被稱為Sipple綜合征。該病呈家族或散發(fā)性發(fā)病，發(fā)病率約為2.8/10萬(wàn)[2]。臨床上，MEN2依據(jù)不同表型又可分為MEN2A、MEN2B及家族性甲狀腺髓樣癌（medullary thyroid carcinoma,MTC）3種亞型，其中MEN2A（在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)171400）是最主要的亞型，占所有MEN2病例的55%[3]。目前，國(guó)外已報(bào)道超過(guò)1 000例的MEN2A散發(fā)或家系病例[4]，國(guó)內(nèi)共報(bào)道80余例散發(fā)和90余例家系病例[5-8]。MEN2A患者的臨床表現(xiàn)為同時(shí)或先后出現(xiàn)2個(gè)或大于2個(gè)的特定性內(nèi)分泌腺增生或腫瘤[9]，但因病變出現(xiàn)時(shí)間早晚不一而常被漏診，早期明確診斷MEN2A對(duì)患者治療方式的選擇以及遺傳干預(yù)有重要意義。

本研究對(duì)1個(gè)MEN2A家系進(jìn)行臨床診療分析及致病基因鑒定，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，探討MEN2A患者的臨床表現(xiàn)、診斷以及基因型與表型間的關(guān)系，旨在提高臨床醫(yī)師對(duì)此類少見(jiàn)內(nèi)分泌疾病的認(rèn)識(shí)。

資料與方法

一、資料

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，家系內(nèi)所有參與研究的成員均簽署知情同意書。

先證者（Ⅱ-3）為33歲的女性，父母為非近親婚配，其為第三胎第三產(chǎn)，足月順產(chǎn)，出生時(shí)身長(zhǎng)、體重與同齡兒相當(dāng)，既往體健。先證者母親（Ⅰ-2）與妹妹（Ⅱ-4）在外院被診斷為MTC，分別于55歲和26歲去世，先證者的2個(gè)姐姐（Ⅱ-1和Ⅱ-2）均健康，無(wú)類似病史（見(jiàn)圖1）。

圖1 MEN2A家系圖

先證者因“骨痛1年余，加重1周”至我科就診。詢問(wèn)病史，患者自述1年前出現(xiàn)雙膝疼痛，1周前出現(xiàn)雙髖疼痛，疼痛持續(xù)，不能自行緩解，下蹲、起立困難?；颊叱Ｓ斜忝?，夜間小便7～8次。體格檢查示，患者身高157.2 cm，體重38.0 kg，體質(zhì)量指數(shù)為15.38 kg/m2；血壓140/80 mmHg，體溫36.6 ℃。實(shí)驗(yàn)室檢查可見(jiàn)血鈣、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）和降鈣素等均升高（見(jiàn)表1）。雙能X射線吸收儀（豪洛捷公司，美國(guó)）測(cè)定第1腰椎至第4腰椎、股骨頸和全髖骨密度Z值分別為-5.4 SD、-5.1 SD和-5.3 SD?；颊呒谞钕偌凹谞钆韵貰超顯示，左側(cè)甲狀腺下極背側(cè)見(jiàn)實(shí)性低回聲腫塊，形態(tài)不規(guī)則，甲狀旁腺腫瘤可能；雙側(cè)甲狀腺多發(fā)結(jié)節(jié)；雙側(cè)頸部血管旁可見(jiàn)數(shù)個(gè)淋巴結(jié)。全身核素骨顯像結(jié)果顯示，全身多發(fā)骨代謝異常，顱骨彌漫性放射性攝取增高，呈“帽征”，兩側(cè)多發(fā)肋骨、雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)和雙側(cè)股骨對(duì)稱性放射性攝取增高，考慮為甲狀旁腺亢進(jìn)（甲旁亢）骨病。遂以“多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤”將患者收入外科病房，并行全身麻醉下左側(cè)甲狀旁腺腫瘤切除術(shù)、左側(cè)甲狀腺全部切除術(shù)、左側(cè)中央?yún)^(qū)頸淋巴結(jié)清掃術(shù)。術(shù)后標(biāo)本經(jīng)病理檢查診斷為左側(cè)MTC（直徑0.6 cm）；左側(cè)頸部中央?yún)^(qū)1枚淋巴結(jié)見(jiàn)癌轉(zhuǎn)移；左側(cè)甲狀旁腺腫瘤呈多結(jié)節(jié)性生長(zhǎng)，腫瘤有寬帶樣纖維分隔，局部有包膜浸潤(rùn)，考慮為左側(cè)非典型甲狀旁腺腺瘤。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果示，腫瘤細(xì)胞內(nèi)癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、降鈣素、突觸生長(zhǎng)蛋白、CD56和PTH均為陽(yáng)性，嗜鉻粒蛋白A為部分陽(yáng)性，TG、CK19和半乳凝素3均為陰性，腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)為2%。術(shù)后監(jiān)測(cè)患者的血降鈣素、PTH、鈣等指標(biāo)（見(jiàn)表1）。術(shù)后常規(guī)予患者碳酸鈣D3片600 mg每日1次、骨化三醇0.25 μg每日1次治療。術(shù)后4周，先證者的雙髖疼痛較前稍緩解，運(yùn)動(dòng)功能改善。

表1 先證者術(shù)前、術(shù)后檢查結(jié)果

二、方法

1.RET基因突變檢測(cè)

（1）外周血基因組DNA提取：分別采集先證者（Ⅱ-3）及其二姐（Ⅱ-2）外周血3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中。用全血DNA提取試劑盒(上海萊楓生物科技公司)提取血樣本DNA，用TU-1900紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）檢測(cè)DNA濃度。

（2）PCR擴(kuò)增及突變檢測(cè)：從在線數(shù)據(jù)庫(kù)（Gen-Bank檢索號(hào)NC_000010）中獲得RET原癌基因的DNA序列。引物采用在線Primer 3軟件設(shè)計(jì)（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/），共21對(duì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（引物序列參照文獻(xiàn)[10]），采用PCR進(jìn)行外顯子擴(kuò)增。反應(yīng)體系共20 μL，包括1×PCR預(yù)混液緩沖液Ⅰ（TaKaRa公司）9.5 μL，Mg2+（TaKaRa公司）1 μL，dNTP[捷瑞生物工程（上海）有限公司]1 μL，Hotstar Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）1 μL，上下游引物各1 μL，超純水4.5 μL，DNA樣本1 μL。PCR反應(yīng)條件為，預(yù)變性95 ℃2 min，變性94 ℃20 s，退火58 ℃～68 ℃（根據(jù)不同引物調(diào)整）40 s，延伸72 ℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；終端延伸72 ℃2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶（Promega公司）和外切酶Ⅰ（EXO Ⅰ）（Epicentre公司）純化后，用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems International inc.）（ABI）的BigDye 3.1試劑盒及ABI 3730自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序文件用PolyPhred軟件進(jìn)行分析，再結(jié)合人工校對(duì)，記錄后整理出結(jié)果。

2.致病性及保守性分析：利用在線PolyPhen 2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）及 Mutation Master（http：//www.mutationtaster.org/）預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)的致病性，使用UniProt（https：//www.uniprot.org/）軟件分析突變氨基酸在不同物種間的保守性。

結(jié)果

一、RET基因突變檢測(cè)

經(jīng)Sanger法測(cè)序發(fā)現(xiàn),先證者的11號(hào)外顯子發(fā)生雜合錯(cuò)義突變c.1901G＞A（見(jiàn)圖2），其編碼的蛋白質(zhì)第634位氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)槔野彼幔╬.Cys634Tyr）。先證者的健康姐姐及300例對(duì)照人群未發(fā)現(xiàn)上述基因突變位點(diǎn)。

圖2 先證者RET基因突變檢測(cè)結(jié)果

二、致病性及保守性分析

PolyPhen 2及Mutation Master軟件均預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)為致病突變，預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)均為1.00 （見(jiàn)圖3）。UniProt軟件分析示，p.Arg634在不同物種間高度保守（見(jiàn)圖4）。

圖3 PolyPhen 2軟件預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)的致病性

圖4 RET基因634位氨基酸保守性分析

討論

一、先證者與家系成員的診斷過(guò)程

本研究報(bào)道的MEN2A家系先證者以骨痛為首發(fā)癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示血鈣、PTH及降鈣素水平升高，B超檢查發(fā)現(xiàn)單側(cè)腎結(jié)石，最終經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)存在單側(cè)甲狀旁腺腺瘤和MTC，結(jié)合RET基因突變檢測(cè)結(jié)果，最終明確診斷為MEN2A。因先證者母親及妹妹先后在外院被診斷為MTC，由此推斷其母親及妹妹發(fā)病的分子遺傳學(xué)機(jī)制也可能為RET基因突變，故該家系為RET基因突變導(dǎo)致的MEN2A家系。

二、MEN2A患者的臨床表現(xiàn)及診斷

MEN2A是多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤的一種亞型，臨床表現(xiàn)主要包括MTC、嗜鉻細(xì)胞瘤（pheochromocytoma，PCC）和原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥（primary hyperparathyroidism，PHPT）[9]，少數(shù)患者可出現(xiàn)肩胛間區(qū)皮膚苔蘚淀粉樣變和（或）先天性巨結(jié)腸[11]。在MEN2A患者中，MTC的發(fā)生率＞90%[3]，早期患者常無(wú)特殊癥狀，往往是經(jīng)觸診和（或）甲狀腺影像學(xué)檢查時(shí)意外發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)血清降鈣素水平以及甲狀腺超聲和甲狀腺結(jié)節(jié)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查可確診[12]。PCC的發(fā)生率占MEN2A的40%～50%[3]，常為雙側(cè)、多發(fā)，患者臨床表現(xiàn)為陣發(fā)性高血壓、頭痛、心悸以及多汗等，可通過(guò)檢測(cè)血或24 h尿甲氧基腎上腺素及甲氧基去甲腎上腺素濃度進(jìn)行定性診斷；CT或MRI檢查對(duì)PCC也有較好的診斷靈敏度，可用于定位診斷[13]；功能影像學(xué)定位則首選碘-123-間位碘代芐胍核素顯像，其診斷PCC的靈敏度為85%～88%[9,13-14]。若未發(fā)現(xiàn)腫瘤但定性診斷高度懷疑為PCC，則可進(jìn)一步予行氟-18-二羥基苯丙氨酸正電子發(fā)射斷層成像，其檢出PCC的靈敏度可達(dá)81%～100%[15]。在MEN2A中，PHPT的發(fā)生率為10%～20%[9]，疾病隱匿，早期患者可出現(xiàn)口干、乏力、夜尿增多等癥狀，患者多因骨痛和（或）泌尿系結(jié)石癥狀而首診，測(cè)定血清游離鈣、PTH水平，并行甲狀旁腺B超或锝-99m-甲氧基異丁基異腈單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層顯像以及全身核素骨顯像等輔助檢查，同時(shí)排除繼發(fā)性和散發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)后，方可診斷該病。

三、致病基因及發(fā)病機(jī)制

1993年，Donis-Keller等[16]首次報(bào)道了MEN2A是由RET原癌基因突變所致。RET原癌基因位于染色體10q11.2上，其編碼的酪氨酸激酶受體包含3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域——胞外配體結(jié)合域、疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[17]。其中，胞外配體結(jié)合域包含一個(gè)富含半胱氨酸區(qū)域，而高度保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域?qū)τ诙蜴I的形成至關(guān)重要；其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含10個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可與共受體GFRα1～GFRα4結(jié)合，促使胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，通過(guò)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。突變體通過(guò)半胱氨酸間的二聚體化或者基因的劑量效應(yīng)（突變型的擴(kuò)增或野生型的缺失）增強(qiáng)了RET酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶自動(dòng)磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖以及腫瘤生長(zhǎng)[17]。迄今報(bào)道的導(dǎo)致MEN2A的基因突變均為RET原癌基因突變，且其中85%的突變位于第11外顯子634位點(diǎn)[18]，與本研究一致。另有報(bào)道顯示，少數(shù)突變位于第10外顯子的611、618、620位點(diǎn)和第11外顯子的631位點(diǎn)[2]。RET基因突變位點(diǎn)與MEN2A表型之間有著密切的聯(lián)系，美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)[12]根據(jù)不同的RET突變位點(diǎn)將MTC風(fēng)險(xiǎn)分為中、高、極高3個(gè)等級(jí)。等級(jí)越高，意味著腫瘤侵襲能力越強(qiáng)，甲狀腺手術(shù)需要切除的范圍越大及預(yù)防性切除甲狀腺的年齡越小。位于第11外顯子的634密碼子p.Cys634位點(diǎn)突變（p.Cys634Arg或p.Cys634Gly、p.Cys634Phe、p.Cys634Ser、p.Cys634Trp、p.Cys634Tyr）屬于高風(fēng)險(xiǎn)，與攜帶其他突變位點(diǎn)的患者相比，攜帶該位點(diǎn)突變的患者除了發(fā)生MTC之外，同時(shí)伴有PCC、PHPT的可能性也最大。在MEN2A患者中，MTC表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的外顯率[19-20]，據(jù)報(bào)道，最小的患者只有5歲[18]。因此，美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)建議，該突變位點(diǎn)攜帶者盡可能在5歲之前進(jìn)行預(yù)防性全甲狀腺切除術(shù)（包括或不包括中央淋巴結(jié)切除術(shù)），并盡快開(kāi)始PCC和PHPT的篩查[12]。國(guó)內(nèi)最常見(jiàn)的RET基因突變位點(diǎn)也是第11外顯子的634、611、620、768位點(diǎn)[21-22]。根據(jù)美國(guó)甲狀腺協(xié)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)，611、620、768位點(diǎn)突變提示MTC侵襲力為中度風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)在MTC的基礎(chǔ)上發(fā)生PCC和PHPT的可能性較小，尤其是768位點(diǎn)突變。本研究報(bào)道的該家系先證者為高風(fēng)險(xiǎn)（p.Cys634Tyr），就診時(shí)甲狀腺及甲狀旁腺已經(jīng)累及，術(shù)后病理檢查結(jié)果證實(shí)MTC已發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因先證者在甲狀腺手術(shù)之后進(jìn)行基因診斷，因此對(duì)于其殘存的右側(cè)甲狀腺進(jìn)行了密切隨訪，包括血清降鈣素和癌胚抗原水平檢測(cè)以及頸部B超檢查等。盡管先證者術(shù)后短期隨訪顯示，上述指標(biāo)在正常范圍之內(nèi)（見(jiàn)表1），但結(jié)合其基因診斷，仍建議其進(jìn)行預(yù)防性右側(cè)甲狀腺切除及右側(cè)中央?yún)^(qū)頸淋巴結(jié)清掃手術(shù)，先證者表示愿配合密切隨訪，但暫時(shí)拒絕再次手術(shù)。

四、隨訪及預(yù)后

MEN2A患者的預(yù)后主要由其MTC病情程度決定，相較PCC及PHPT，MTC具有進(jìn)展快、易侵襲、術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。研究表明，MEN2A患者中，MTC伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)50%[23]，并且復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)可持續(xù)至術(shù)后20年左右[24]。因此美國(guó)甲狀腺協(xié)學(xué)指南推薦，MEN2A患者行MTC切除術(shù)后應(yīng)進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，需每6個(gè)月監(jiān)測(cè)血癌胚抗原和降鈣素的水平。頸部體格檢查發(fā)現(xiàn)腫塊以及血生化檢測(cè)降鈣素升高的患者，需行頸部CT檢查以了解MTC復(fù)發(fā)情況[12]。MEN2A患者中，相較于MTC而言，PHPT惡性度低，手術(shù)可治愈，且術(shù)后復(fù)發(fā)率較低，約為4%[25]，患者的預(yù)后良好。但MEN2A患者可能同時(shí)存在2個(gè)或2個(gè)以上的甲狀旁腺腺體的增生，因此PHPT術(shù)后也應(yīng)重視監(jiān)測(cè)血鈣和PTH以及早發(fā)現(xiàn)新發(fā)甲狀旁腺腺瘤或增生。MEN2A患者預(yù)后的關(guān)鍵是干預(yù)術(shù)后復(fù)發(fā)的侵襲性MTC，這也是近年來(lái)該病在國(guó)際上的研究熱點(diǎn)[26]。Elisei等[27]開(kāi)展的一項(xiàng)前瞻性、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照Ⅲ期臨床試驗(yàn)表明，RET受體酪氨酸激酶抑制劑（卡博替尼）相對(duì)安慰劑能夠顯著延長(zhǎng)侵襲性MTC成年患者的無(wú)進(jìn)展生存期（11.2個(gè)月比4.0個(gè)月）。Chuk等[28]開(kāi)展的一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明，卡博替尼能顯著降低侵襲性MTC兒童及青少年患者的降鈣素水平至基線的24%～87%。同時(shí)，對(duì)于攜帶RET基因突變且有生育要求的MEN2A患者，美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)指南[12]建議進(jìn)行體外受精，將排除RET基因突變的受精卵移植入宮內(nèi)，通過(guò)遺傳干預(yù)，切實(shí)阻斷突變的RET基因在下一代傳遞。國(guó)內(nèi)黃荷鳳院士研究團(tuán)隊(duì)對(duì)攜帶RET基因突變的親代體外受精的受精卵進(jìn)行RET基因單倍型篩選，對(duì)MEN2A患者的子代成功進(jìn)行遺傳干預(yù)[29]。

總之，結(jié)合本研究報(bào)道的先證者及其家系成員的臨床特點(diǎn)及基因測(cè)序結(jié)果，先證者為RET基因突變導(dǎo)致的MEN2A診斷明確。結(jié)果提示臨床醫(yī)師應(yīng)對(duì)MEN2A先證者及家系內(nèi)成員進(jìn)行積極的突變基因篩查，從而采取合理、全面的臨床干預(yù)措施，改善患者的預(yù)后及指導(dǎo)其生育。