一株產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌的分離鑒定及發(fā)酵條件研究

金楚杰，吳津，郭偉鑫，勞吳榮，楊鴻，李鵬

(浙江海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江 舟山 316022)

蛋白酶(protease)是重要的工業(yè)酶，常存在于微生物及動(dòng)、植物中，其應(yīng)用廣泛，在食品、環(huán)保、絲綢、醫(yī)藥、飼料、制革、洗滌劑、飼料等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[1-3]。目前對(duì)于海洋來源的堿性蛋白酶研究主要集中在篩選新型堿性蛋白酶和產(chǎn)酶菌株，近幾年有研究報(bào)導(dǎo)了一些具有較高pH適應(yīng)性的海洋來源的菌株[4-6]。海洋微生物處在低溫、高壓、高鹽等的極端環(huán)境中，其代謝產(chǎn)物與陸生微生物相比結(jié)構(gòu)更加新穎，更適合用于極端條件。Sreeja等[7]從海洋細(xì)菌株EngyodontiumalbumBTMFS10中分離到堿性絲氨酸蛋白酶，該酶在部分有機(jī)溶劑和表面活性劑中均具有良好的穩(wěn)定性，具有耐高溫、高pH值的特點(diǎn)。Anjali等[8]從海洋細(xì)菌BacillustequilensisP15的代謝產(chǎn)物中分離到堿性蛋白酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該酶在制革、絲綢方面都具有很好的應(yīng)用前景。

舟山海域具有豐富的海產(chǎn)資源，水產(chǎn)品加工企業(yè)較多，魚蝦蟹貝類等的加工下腳料利用率較低，從下腳料中篩選出具有高酶活性的產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌，并應(yīng)用于飼料行業(yè)，具有很好的研究前景。本研究篩選來源于下腳料的產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行初步研究，并為下一步在基因克隆等方面打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

購買并收集舟山本地興業(yè)集團(tuán)的水產(chǎn)品下腳料，裝于無菌采集瓶，置于4 ℃冰箱，并盡快處理。

1.2 培養(yǎng)基

脫脂奶培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，瓊脂20.0 g，溶解于1 L海水中，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌20 min。脫脂牛奶10.0 g，溶于1 L海水中，115 ℃高壓滅菌30 min。于超凈工作臺(tái)混勻備用。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，溶解于1 L海水中，121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，脫脂奶10.0 g，溶解于海水1 000 mL，pH 8.5，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.3 菌株的分離和篩選

取10 g下腳料，用組織搗碎機(jī)粉碎后置于加入90 mL無菌水的三角燒瓶中(內(nèi)裝玻璃珠)，搖床震蕩30 min充分混勻，進(jìn)行梯度稀釋，即取0.5 mL樣品加入裝4.5 mL無菌水的試管中，即得樣品濃度為10-2，依次制備10-3～10-6濃度，取10-4～10-6樣品0.1 mL涂布于脫脂奶培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度至少做9個(gè)重復(fù)，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，待菌落生長(zhǎng)后觀察有無透明圈產(chǎn)生，挑取周邊有透明圈的菌落進(jìn)行劃線(脫脂奶平板中)，重復(fù)3次，得到純菌株。

1.4 蛋白酶活性的測(cè)定

將篩選到的菌株接種于種子培養(yǎng)基，28 ℃，120 r·min-1，培養(yǎng)20 h，取1 mL種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝瓶量50/250 mL，28 ℃，120 r·min-1，培養(yǎng)48 h后，5 000 r·min-1離心，取上清粗酶液，利用Folin-酚法進(jìn)行酶活測(cè)定。

蛋白酶活力：以酪蛋白為底物，每分鐘水解產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.5 菌株的分子鑒定

由天根生化科技(北京)有限公司提供試劑盒(TIANamp BacteriaDNA Kit)提取染色體DNA，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，后利用產(chǎn)物純化試劑盒回收，回收的DNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。測(cè)序得到的序列，上傳BLAST進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果采用MEGA 4.0的鄰接方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9-11]。

1.6 單因素實(shí)驗(yàn)

將斜面保種純菌株，先用種子培養(yǎng)基進(jìn)行活化，按照接種量5%分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。分別取培養(yǎng)時(shí)間24、36、48、60、72 h的發(fā)酵液，NaCl濃度為1 g·L-1，初始pH 7.5，發(fā)酵溫度為30 ℃，進(jìn)行酶活的測(cè)定；分別調(diào)整發(fā)酵液的初始pH值為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，NaCl濃度為1 g·L-1，測(cè)酶活；分別調(diào)整1 L發(fā)酵液中NaCl的含量5、15、25、35、45 g，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h，初始pH 7.5，測(cè)酶活；培養(yǎng)溫度分別在25、30、35、40、45、50 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，初始pH 7.5，培養(yǎng)時(shí)間48 h，NaCl濃度為1 g·L-1，測(cè)酶活。

1.7 BBD響應(yīng)面分析法

利用Box-Behnken(Design-expert 10.0 USA)對(duì)影響酶活的3個(gè)最主要因素進(jìn)行觀察，進(jìn)行培養(yǎng)條件最優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定精確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

脫脂平板篩選結(jié)果顯示，從魚蝦蟹等下腳料中篩選到一株有較大透明圈的海洋蛋白酶生產(chǎn)細(xì)菌菌株，菌落在脫脂平板中產(chǎn)黑棕色色素，產(chǎn)生的透明圈較大，透明圈直徑/菌落直徑為3.8(圖1)。

圖1 脫脂平板的篩選結(jié)果

2.2 酶活測(cè)定

先繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線如圖2所示，其中R2=0.997 4，曲線表現(xiàn)出較好的線性相關(guān)性。利用Folin-酚法進(jìn)行酶活測(cè)定，將測(cè)試的樣品吸光值帶入公式，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次，取平均值，得到最終的粗酶活性為88.6 U·mL-1。

圖2 酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 菌株鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行，將序列上傳至NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì)，后用MEGA 5.0的鄰接(N-J)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，并將序列上傳至GenBank，獲得菌株的登錄號(hào)為MK053886。該菌株與BacillscereusHFBP18、BacillscereusATCC 141579等菌株在進(jìn)化關(guān)系上最近，相似性達(dá)到100%，菌株SP1屬于蠟樣芽胞桿菌Bacillscereus，因此，命名菌株SP1為BacillscereusSP1。

圖3 菌株SP1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

分別觀察不同培養(yǎng)時(shí)間(24、36、48、60、72 h)、不同初始pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、不同NaCl濃度(5、15、25、35、45 g·L-1)以及不同培養(yǎng)溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)的酶活變化曲線，結(jié)果如圖4所示。

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)時(shí)間為48 h、pH在7.0～8.5、NaCl濃度25 g·L-1、培養(yǎng)溫度40 ℃時(shí)，菌株的酶活性最強(qiáng)，酶活的曲線均表現(xiàn)為先升高再降低。同時(shí)在NaCl濃度為45 g·L-1時(shí)也表現(xiàn)出較好的酶活，說明該菌株具有較好的鹽度耐受性。

2.5 BBD響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)條件

為了優(yōu)化培養(yǎng)條件，選擇3個(gè)關(guān)鍵因素A培養(yǎng)溫度、B初始pH值、CNaCl濃度，采用Design-Expert 10.0軟件響應(yīng)面設(shè)計(jì)中的Box-Behnken方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)(表1)。其中以酶活作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)17組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

將3個(gè)因素進(jìn)行組合，得到一個(gè)17次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，輸入Design-Expert 10.0軟件，得到相應(yīng)的二次方回歸方程，其中Y表示響應(yīng)值。

Y=92.4-7.51A-7.00B-8.59C+4.45AB+4.97AC-4.35BC-17.89A2-9.06B2-5.09C2。

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差及顯著性的分析，模型的P值<0.000 1，說明該模型顯著。分析結(jié)果顯示，因素A、B、C3個(gè)因素的P值分別為0.000 2、0.000 2及<0.000 1，均<0.05，表明該3個(gè)因素均影響顯著。失擬項(xiàng)的F值是0.77，意味著缺乏擬合相對(duì)于純誤差不顯著，“Adeq Precision”表示該模型的精密度，用于測(cè)試信噪比，當(dāng)模型的“Adeq Precision”值≥4時(shí)，表明該設(shè)計(jì)模型符合要求。分析結(jié)果顯示此次模型的“Adeq Precision”值為16.67，充分說明該模型設(shè)計(jì)符合對(duì)三因素的優(yōu)化。

圖4 單因素對(duì)酶活的影響

表1 3種因素水平及對(duì)酶活的影響

關(guān)于3個(gè)因素之間交互影響的結(jié)果，如圖5所示。從圖中可以看出，3個(gè)因素中B、C的交互影響最小，從顯著性分析也可以看出B、C的P值最大，為0.019 8，在設(shè)計(jì)培養(yǎng)條件時(shí)，應(yīng)該優(yōu)先考慮P值最小的兩因素之間的交互作用，該模型結(jié)合顯著性分析顯示A和C之間的交互影響最大，A、C的P值為0.010 9，因素A和C直接交互作用的3D和等高線圖，如保持NaCl濃度不變，蛋白酶活性隨著溫度升高，后快速下降，在優(yōu)化培養(yǎng)條件時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮NaCl濃度對(duì)酶活的影響。

圖5 3種因素對(duì)功率密度交互影響的三維曲面和等高線

求導(dǎo)回歸方程，得到三因素的真實(shí)值分別為A=35.7 ℃；B=7.7；C=1.07 g·L-1，此時(shí)的酶活為97.65 U·mL-1。重新調(diào)整培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35.7 ℃、初始pH 7.7、NaCl濃度為20.7 g·L-1、培養(yǎng)時(shí)間48 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1，5%的接種量，實(shí)際酶活為101.8 U·mL-1，比優(yōu)化前的酶活88.6 U·mL-1提高了14.9%，預(yù)測(cè)精度達(dá)到95.8%，同時(shí)也證明采用響應(yīng)面BBD法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)的可行性。

3 小結(jié)與討論

從舟山海水加工廠廢棄?mèng)~蝦蟹等下腳料中分離篩選到一株產(chǎn)堿性蛋白酶的海洋細(xì)菌，使用Folin-酚法進(jìn)行酶活測(cè)定，初始酶活為88.6 U·mL-1，利用16S rDNA進(jìn)行分子鑒定，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹結(jié)果顯示該菌株屬于蠟樣芽胞桿菌，并命名為BacillscereusSP1。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)時(shí)間48 h、初始pH 8.5、NaCl濃度25 g·L-1、培養(yǎng)溫度40 ℃時(shí)對(duì)應(yīng)的酶活性最高。Box-Behnken Design方法進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化設(shè)計(jì)培養(yǎng)條件，結(jié)果表明,培養(yǎng)溫度35.7 ℃、初始pH 7.7、NaCl濃度為20.7 g·L-1、培養(yǎng)時(shí)間48 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1，5%的接種量，實(shí)際酶活為101.8 U·mL-1，比優(yōu)化前的酶活提高了14.9%，預(yù)測(cè)精度達(dá)到95.8%。

目前，產(chǎn)蛋白酶的微生物的研究主要包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、黃桿菌屬(Flavobacterium)等[12-14]。蛋白酶是一類在堿性pH值范圍時(shí)，能高效水解蛋白質(zhì)的一類酶，其分子量大概在26 000～34 000 Da，大部分蛋白酶具有絲氨酸活性中心，并具有很強(qiáng)的底物特異性[15]。研究具有特殊性能的堿性蛋白酶以及蛋白酶工程菌是目前的熱點(diǎn)[16]，K. Adinarayana等[17]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在60 ℃環(huán)境中仍具有較好的酶活穩(wěn)定性能。馮清平等[18-19]篩選到一株嗜堿性的地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis53-A6，經(jīng)過選育，獲得了一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株。劉成圣等[20]從海洋弧菌Vibrio pacini X4B-7的發(fā)酵液中獲得產(chǎn)堿性蛋白酶，研究發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)DNA酶具有專一地降解作用。

海洋的低溫、高壓、高鹽等極端環(huán)境，導(dǎo)致海洋微生物具有別于陸生微生物的不同代謝途徑，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)往往更加新穎，更適合用于極端條件的研究。本研究獲得的來源于魚蝦蟹下腳料中的海洋產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，為更好利用海洋資源，構(gòu)造高產(chǎn)蛋白酶工程菌提供一定的研究基礎(chǔ)。