桃細(xì)菌性穿孔病病原鑒定

趙文靜，紀(jì)兆林，葛金濤，繆美華，劉興滿*

(1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000； 2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225000)

桃樹在我國已有3000年的栽培歷史，在《齊民要術(shù)》上就有關(guān)于桃樹生長特性、繁殖特點(diǎn)、栽培技術(shù)的詳盡記載[1-2]。隨著科技的發(fā)展，人們在栽培和管理桃樹方面有了長足的進(jìn)步。

桃樹是連云港市栽培數(shù)量較多的一種果樹，根據(jù)連云港市自然資源與規(guī)劃局的統(tǒng)計(jì)，在2018年連云港地區(qū)桃園面積達(dá)5 000 hm2左右。隨著果園管理的日益規(guī)范和對桃樹種植經(jīng)濟(jì)價(jià)值的追求，果農(nóng)們對桃樹上出現(xiàn)的病害也越發(fā)關(guān)注。近幾年，連云港地區(qū)桃細(xì)菌性穿孔病的爆發(fā)日益頻繁，嚴(yán)重為害了桃樹葉片和果實(shí)，給果農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究采集了連云港市桃園中出現(xiàn)的桃穿孔病病樣，采用形態(tài)特征和 16S-23SrDNAITS分子鑒定方法進(jìn)行病原鑒定。病原菌研究結(jié)果表明，引起連云港地區(qū)桃細(xì)菌性穿孔病的病原為樹生黃單胞菌李致病變種Xanthomonasarboricolapv.pruni(Xap)(異名：Xanthomonascampestrispv.pruni，Xanthomonaspruni)，本研究旨在為連云港市的桃細(xì)菌性穿孔病的預(yù)防和病原鑒定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病害樣本采集

2019年7月于連云港班莊鎮(zhèn)桃樹種植園中采集具有典型病害癥狀的桃樹穿孔病葉，記錄其為害癥狀特點(diǎn)。

1.2 病原菌的分離、純化與保存

采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離[3]。首先用清水將病樣表面沖洗干凈、晾干，然后用刀片取病葉病健交界處組織數(shù)塊2 mm見方，接著將病樣組織浸漬于0.5%的次氯酸鈉溶液消毒1 min，再用無菌水沖洗2～3次，隨后浸漬在少量無菌水里，用滅菌玻棒搗爛，使組織內(nèi)細(xì)菌溢出。最后用接菌環(huán)蘸取菌液在NA平板劃線后將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長出后，用接菌環(huán)挑取單菌落進(jìn)行劃線純化，如此重復(fù)純化3～4次。

取純化后新鮮的單菌落于NB試管中，于180 r·min-1、28 ℃過夜搖菌，取1 mL菌液離心去上清，然后沉淀加入200 μL 20%的甘油混勻，-80 ℃保存。

1.3 病菌種類鑒定

1.3.1 形態(tài)特征觀察

觀察分離菌株在NA平板上的菌落形態(tài)、顏色及色素產(chǎn)生等情況，并拍照記錄菌落形態(tài)特征。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

DNA提取。將保存的菌株在NA平板上活化，蘸取新生長的單菌落于NB試管中，于180 r·min-1、28 ℃下過夜搖菌，之后參照生工生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌的DNA，并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測gDNA的質(zhì)量，于-20 ℃下保存。

16S-23S ITS序列擴(kuò)增。以病原菌的gDNA為模板，采用細(xì)菌通用引物16S-23S ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：ITS-f：5′-AGTCGTAACAAC GTAGCCGT-3′；ITS-r：5′-GTGCCAAGGCATCCAC C-3′。采用50 μL PCR擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ITS-f/ITS-r(10 μM)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，并于4 ℃終止反應(yīng)。取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后送往公司測序。將測序病原菌rDNA-16S-23S ITS的序列在Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，篩選與分離菌株相似度較高的同源DNA序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

桃細(xì)菌性穿孔病主要為害桃樹的葉片和果實(shí)。在病害初期主要是在侵染葉片，先在葉片上形成水漬狀斑點(diǎn)，隨后病部組織逐漸壞死形成褐色病斑，病斑慢慢干枯脫落，形成葉片穿孔癥狀，病情嚴(yán)重時(shí)病斑接連成片，造成葉片大量脫落，引起樹勢衰弱(圖1)。同時(shí)，桃細(xì)菌性穿孔病菌也會(huì)在桃果實(shí)上形成病斑，初時(shí)為淡褐色水漬狀小圓斑且病斑邊緣有黃綠色暈圈，隨后病斑逐漸擴(kuò)大，嚴(yán)重時(shí)病斑接連，造成果實(shí)凹裂，天氣潮濕時(shí)，還易產(chǎn)生含菌膿的黏質(zhì)分泌物等，造成果樹極大的減產(chǎn)。

圖1 桃細(xì)菌性穿孔病病葉

2.2 病原菌形態(tài)

將保存的病原菌純化2～3次后，觀察到菌體菌落呈淡黃色、濕潤、黏稠、飽滿的狀態(tài)(圖2)。

圖2 桃細(xì)菌性穿孔病菌純化后形態(tài)

2.3 病原菌16S-23S ITS序列分析

本研究以3個(gè)分離菌DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物16S-23S ITS序列對這3個(gè)分離菌株L-1、L-2和L-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得3條600 bp大小的清晰條帶(圖3)。將擴(kuò)增產(chǎn)物送公司測序，通過測序結(jié)果和BLAST同源比對分析發(fā)現(xiàn)，3株分離株的16S-23S rDNA ITS序列與Xanthomonasarboricolapv.pruni相似性最高，達(dá)95%以上，從而初步支持這3株分離菌株為樹生黃單胞菌李致病變種(Xanthomonasarboricolapv.pruni)。

圖3 基于16S-23S rDNA ITS序列部分菌株擴(kuò)增凝膠電泳

3 小結(jié)與討論

通過病害形態(tài)觀察和分子生物學(xué)方法，觀察病害的病部癥狀、菌株形態(tài)，同時(shí)比對分析分離株的擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，分離株與Xanthomonasarboricolapv.pruni相似性最高，初步鑒定為Xanthomonasarboricolapv.pruni。

通過對致病菌Xanthomonasarboricolapv.pruni的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，早在1903年北美就首次報(bào)道了該病原能夠侵染日本李子[4]；70年代中期，意大利東北部爆發(fā)桃細(xì)菌性穿孔病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]；2014年阿拉貢地區(qū)同樣爆發(fā)該病害，造成杏仁的大減產(chǎn)[6]。之后在日本、法國、德國、俄羅斯、西班牙、瑞士等國家也陸續(xù)有該病原的報(bào)道[7]。由于該病害給果園帶來巨大減產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，歐盟和EPPO等地區(qū)已決定將Xap列為檢疫性病原物[8-10]。

通過觀察該病害的發(fā)生與流行發(fā)現(xiàn)，該病害一般在5月初就出現(xiàn)癥狀，在高溫多雨的6—8月病情較重，即病情的發(fā)生嚴(yán)重程度可能與降雨量、濕度、溫度都有一定的相關(guān)性。為有效地防控桃細(xì)菌性穿孔病，將在其生物學(xué)特性、發(fā)生規(guī)律、傳播途徑和防控技術(shù)等方面做進(jìn)一步研究。