3種新型冠狀病毒核酸檢測試劑對120份樣本檢測結(jié)果的比較與分析

曾林子，田自城，黃玉蘭，韓聲付，肯 布，張光慧，賈春燕，楊小蓉

2019年12月，湖北省武漢市首先公開通報(bào)新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情以來，全世界多個(gè)國家也相繼報(bào)道了此類病例[1]。根據(jù)新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)規(guī)定，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性為確診病例的病原學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)之一[2]。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)具有結(jié)果直觀、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高和易操作等優(yōu)點(diǎn)[3]。目前，具備國家醫(yī)療器械注冊證的新冠病毒(SARS-CoV-2)核酸檢測試劑(熒光PCR法)有多家，各種檢測試劑盒對樣本檢測是否存在差異？檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)該如何選擇新冠病毒核酸檢測試劑？本研究選擇其中3種新冠病毒核酸檢測試劑對120份新冠肺炎病人和密切接觸者的樣本進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果加以分析和比較，供檢測機(jī)構(gòu)參考。

1 材料與方法

1.1樣本 隨機(jī)選取120份新冠肺炎病人和密切接觸者樣本(樣本包括同一新冠肺炎病人不同采集時(shí)間或者不同類型的樣本)，包括咽拭子60份(新冠肺炎病人51份，密切接觸者9份)、唾液20份(新冠肺炎病人)、尿液20份(新冠肺炎病人)、糞便20份(新冠肺炎病人)。

1.2試劑 采樣管采用江蘇醫(yī)療用品采樣公司生產(chǎn)的一次性使用病毒采樣管。3種市售的核酸檢測試劑盒分別為3個(gè)不同公司生產(chǎn)試劑，A試劑(批號(hào)：2019002)、B試劑(批號(hào)：20200123C)和C試劑(批號(hào)：2020017)。

1.3儀器 核酸提取采用Natch S全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)(湖南圣湘生物科技股份有限公司),核酸擴(kuò)增采用SLAN-96S熒光定量PCR儀(上海宏石生物科技股份有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1樣本處理 將樣本放置于56 ℃培養(yǎng)箱中30 min滅活。滅活后，對不同類型樣本分別進(jìn)行處理。

1.4.1.1咽拭子 充分混勻后吸取200 μL進(jìn)行核酸提取。

1.4.1.2尿液 充分混勻后吸取200 μL進(jìn)行核酸提取。

1.4.1.3唾液 加入400 μL病毒保存液，充分混勻后，吸取200 μL 進(jìn)行核酸提取。

表1 3種試劑盒檢測參數(shù)比較

1.4.1.4糞便 挑取黃豆粒大小的便標(biāo)本加至50 mL離心管中，吸取2 mL TRIzol加至離心管中與糞便混勻,室溫靜置10 min，吸取600 μL上清液，5 000 r/min離心5 min，取200 μL上清液進(jìn)行核酸提取。

1.4.2核酸提取 使用圣湘生物Nathch CS全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)，嚴(yán)格按照儀器使用手冊進(jìn)行提取。

1.4.3核酸擴(kuò)增 分別按照3個(gè)試劑廠家的檢測說明書配置反應(yīng)體系及設(shè)置相應(yīng)的反應(yīng)程序和檢測熒光通道，同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對照，反應(yīng)結(jié)束后嚴(yán)格參照各試劑使用說明書進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4.4統(tǒng)計(jì)方法 使用SPSS 20.0軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用χ2檢驗(yàn)對檢測陽性率進(jìn)行差異性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過計(jì)算Kappa值，分析檢測結(jié)果的一致性：K<0.40，一致性較差；0.4≤K<0.75，一致性中等；K≥0.75，一致性較好。

2 結(jié) 果

2.1各種試劑基本情況 3種新型冠狀病毒核酸檢測試劑基本情況比較見表1。3種試劑均檢測新冠病毒基因組中開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab，ORF-1ab)和核衣殼蛋因(Nucleocapsid，N)。A試劑、B試劑和C試劑的最低檢出限分別為200 copies/mL、1000 copies/mL和500 copies/mL，3種試劑核酸加樣量、熒光檢測和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)及結(jié)果判斷有差異。本研究采用的標(biāo)本類型為病人和密切接觸者的咽拭子、糞便、尿液和唾液樣本，3種試劑均適用。本研究僅針對各試劑相應(yīng)批號(hào)。

2.2 3種試劑檢測結(jié)果

2.2.1咽拭子檢測結(jié)果 對60份咽拭子進(jìn)行核酸檢測結(jié)果為：A試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性41份，陰性9份,單陽性10份(均為N基因陽性)，陽性檢出率68.33%(41/60)；B試劑檢出陽性39份，陰性13份,單陽性8份(包括6份N基因陽性和2份1ab基因陽性)，陽性檢出率為65.00%(39/60)；C試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性40份，陰性13份,單陽性7份(包括1份N基因陽性和6份1ab基因陽性)，陽性檢出率為66.67%(40/60),詳細(xì)情況見表2。通過SPSS軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，A試劑、B試劑和C試劑對咽拭子樣本的陽性檢出率無顯著性差異(χ2=0.15,P>0.05)

2.2.2尿液檢測結(jié)果 對20份尿液進(jìn)行核酸檢測結(jié)果為：A試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性3份，陰性4份,單陽性13份(均為N基因陽性)，陽性檢出率15.00%(3/20)；B試劑檢出陽性3份，陰性15份,單陽性2份(均為N基因陽性),陽性檢出率為15.00% (3/20)；C試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性3份，陰性11份,單陽性6份(均為1ab基因陽性),陽性檢出率為15.00%(3/20)。3種試劑對尿液的陽性檢出率相同，詳細(xì)情況見表2。

2.2.3唾液檢測結(jié)果 對20份唾液進(jìn)行核酸檢測結(jié)果為：A試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性2份，陰性14份,單陽性4份(均為N基因陽性)，陽性檢出率10.00%(2/20)；B試劑檢出陽性2份，陰性18份，陽性檢出率為10.00% (2/20)；C試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性2份，陰性16份,單陽性2份(均為1ab基因陽性), 陽性檢出率為10.00%(2/20)。3種試劑對唾液的陽性檢出率相同，詳細(xì)情況見表2。

2.2.4糞便檢測結(jié)果 對20份糞便進(jìn)行核酸檢測結(jié)果為：A試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性5份，陰性13份,單陽性2份(均為N基因陽性)，陽性檢出率25.00%(5/20)，B試劑檢出陽性3份，陰性13份，單陽性4份(包括3份N基因陽性和1份1ab基因陽性)，陽性檢出率為15.00% (3/20)；C試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性5份，陰性14份,單陽性1份(1ab基因陽性),陽性檢出率為25.00%(5/20)，詳細(xì)情況見表2。通過SPSS軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，A試劑、B試劑和C試劑對糞便樣本的陽性檢出率無顯著性差異(χ2=0.786，P>0.05)。

表2 四種樣本檢測結(jié)果

2.2.53種試劑檢測總結(jié)果 對120份樣本進(jìn)行核酸檢測結(jié)果為：A試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性51份，陰性40份,單陽性29份(均為N基因陽性)，陽性檢出率為42.50%(51/120)；B試劑檢出陽性47份，陰性59份,單陽性14份(包括11份N基因陽性和3份1ab基因陽性)，陽性檢出率為39.17%(47/120)；C試劑所有樣本的內(nèi)標(biāo)均檢出，檢出陽性50份，陰性54份,單陽性16份(包括1份N基因陽性和15份1ab基因陽性),陽性檢出率為41.67%(50/120)，詳細(xì)情況見表3。通過SPSS軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，A試劑、B試劑和C試劑的陽性檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.298，P>0.05)。

表3 三種試劑檢測結(jié)果

2.2.63種試劑檢測結(jié)果一致性 120份樣本中，3種試劑檢測結(jié)果一致的樣本數(shù)有89份，均為陽性的樣本有43份，均為單陽的有6份，均為陰性的有40份，3種試劑檢出結(jié)果有差異的樣本有31份，3種試劑檢測結(jié)果差異見表4。A試劑檢出51份陽性樣本中，B試劑檢出陽性46份，另外5份為4份單陽(2份N單陽，2份1ab單陽)和1份陰性，C試劑檢出陽性47份，另外4份結(jié)果為2份單陽(均為1ab單陽)和2份陰性。C試劑檢出50份陽性樣本中,B試劑檢出陽性44份，另外6份均單陽(5份1ab單陽，1份N單陽)，A試劑檢出陽性47份，另外3份均為單陽(N單陽)。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，A試劑和B試劑檢測結(jié)果基本一致(K=0.688)，差異在于A試劑比B試劑更容易檢測出單陽；A試劑和C試劑檢測結(jié)果一致性較好(K=0.753)；B試劑和C試劑檢測結(jié)果基本一致(K=0.736)。一致性從高到低為：A試劑和C試劑>B試劑和C試劑>A試劑和B試劑。檢測結(jié)果一致性比對見表5、表6和表7。

表4 三種試劑檢測結(jié)果差異一覽表

表5 A試劑和B試劑檢測結(jié)果一致性對比

表6 A試劑和C試劑檢測結(jié)果一致性對比

表7 B試劑和C試劑檢測結(jié)果一致性對比

3 討 論

本研究使用3種新型冠狀病毒核酸檢測試劑對120份樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，3種試劑對同一批樣本的陽性檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是由于各試劑的檢出限不同，陽性檢出率也有不同，檢出限越小的試劑，靈敏度越高，陽性率越高。A試劑、B試劑、C試劑的最低檢出限分別200 copies/mL、1 000 copies/mL和500 copies/mL，本研究中，A試劑陽性率>C試劑陽性率>B試劑陽性率，與最低檢出限吻合。

本研究結(jié)果顯示，3種試劑盒檢測結(jié)果差異較大的是單靶標(biāo)陽性(1ab陽性或者N陽性)。A試劑的檢測出的單陽最多(29份)，均為N單陽；C試劑16份，以1ab單陽為主(15份)；B試劑13份，以N單陽為主(11份)。分析原因，可能是各試劑廠家不同靶標(biāo)基因位點(diǎn)的試劑檢測敏感度不同，試劑中酶、金屬離子等成分與質(zhì)量有差異，擴(kuò)增體系時(shí)加入的模板量不同，都能影響擴(kuò)增效率和最后的檢測結(jié)果[4-6]。A試劑的檢出限低于B試劑和C試劑，同時(shí)可能由于A試劑中的N基因的檢測靈敏度高于1ab，所以導(dǎo)致某些病毒載量較低的樣本使用A試劑檢測N單陽的結(jié)果較多，而C試劑中1ab的檢測靈敏度高于N,從而以1ab單陽為主。單靶標(biāo)陽性對結(jié)果的判讀和病例的確診帶來了困擾，對此類標(biāo)本要引起足夠重視，判讀時(shí)除了嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行外，需要按照規(guī)范要求重新采集樣本，重新提取核酸檢測，如果仍然為單靶標(biāo)陽性，判定為陽性；如果兩種標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽性，可判定為陽性[7]。

本次研究中使用的3種新型冠狀病毒核酸檢測試劑，兩種帶有內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)，通過內(nèi)標(biāo)的檢測，可以對標(biāo)本采集、核酸提取及PCR擴(kuò)增過程進(jìn)行質(zhì)量控制，避免人為造成檢測結(jié)果假陰性[4-5,9]。對于檢測中內(nèi)標(biāo)沒有檢出的樣本，需要逐一排除問題，在確保PCR擴(kuò)增和核酸提取都沒有問題的情況下，應(yīng)該再次采集樣本重新檢測。鑒于內(nèi)標(biāo)在檢測中的質(zhì)控作用，檢測機(jī)構(gòu)可選擇帶有內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)的試劑。除了內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)作為質(zhì)控，湖北省臨檢中心的做法值得借鑒[10]，在核酸檢測過程設(shè)置“三陰一陽”作為質(zhì)控，具體做法是每批檢測設(shè)立1個(gè)弱陽性質(zhì)控和3個(gè)陰性質(zhì)控(生理鹽水)，3份陰性質(zhì)控隨機(jī)放在臨床檢測標(biāo)本中。弱陽性質(zhì)控測定為陽性，3份陰性質(zhì)控全部測定為陰性，視為在控，反之，則為失控。

新冠病毒是一種新的病毒，對它的研究和認(rèn)識(shí)還不夠深入，目前，全國出現(xiàn)多例新冠患者核酸檢測轉(zhuǎn)陰后又復(fù)陽的情況，這可能與樣本采集和運(yùn)輸有關(guān)系，也跟實(shí)驗(yàn)室的儀器設(shè)備和檢測試劑等有關(guān)系。新冠病毒的檢測試劑在極緊迫而短暫的情況下研制和生產(chǎn)出來，面對市面上出售的各種新型冠狀病毒核酸檢測試劑，各檢測機(jī)構(gòu)在條件允許的情況下，除了上述質(zhì)控手段，還可采用試劑比對來確保實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果準(zhǔn)確性，為新冠肺炎疫情的防控工作提供科學(xué)客觀的數(shù)據(jù)支持。

利益沖突：無