木質素降解酶的酶活測試方法的評價與分析

崔堂武，袁波，2，凌晨，方彬任，毛向陽，費強，2

（1 西安交通大學化學工程與技術學院，陜西西安710049；2 陜西省能源化工過程強化重點實驗室，陜西西安710049）

化石資源逐漸枯竭是現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)與城鎮(zhèn)化面臨的重要問題，因此尋找一種能夠代替化石能源的可再生清潔能源至關重要。木質素作為自然界含量最大的可再生芳香族物質[1]，主要來源于農(nóng)林廢棄物和造紙工業(yè)廢水[2]。但農(nóng)林廢棄物的隨意堆積焚燒和造紙工業(yè)廢水的肆意排放不僅污染環(huán)境，還導致木質素資源的嚴重浪費。松柏醇（G-lignin）、香豆醇（H-lignin）和芥子醇（S-lignin）是木質素的三種主要單體（圖1），它們通過C—C、C—O 和β-O-4等共價鍵組合連接形成無定形的三維網(wǎng)狀結構[3-4]。但是由于木質素分子量較大、沒有規(guī)則的重復單元、分子上缺乏親水和親油的官能團等特點，使其具有不均勻性、無旋光性、高度分散和在水與有機溶劑中溶解度低等性質，從而導致木質素難以被有效利用[5]。木質素的高效利用可以為生物能源和大宗化學品的獲取提供充足的原材料[6]，因此開發(fā)對木質素合理利用的新途徑和新工藝，不僅會減少對環(huán)境的影響，而且還會帶來巨大的經(jīng)濟效益。目前在木質素的降解方法中，物理和化學法具有反應速率較快和反應高效等優(yōu)點，但大多數(shù)反應依賴于高溫高壓或強酸強堿，反應條件極端，并且在一定程度上污染環(huán)境。生物法降解木質素具有綠色、安全、專一和可持續(xù)性等優(yōu)點，但缺點是反應處理時間較長，反應強度較低。本文主要側重于生物法的相關研究。

木質素的生物降解主要依靠微生物體內分泌的木質素降解酶完成，主要包括：漆酶（laccase,Lac）、 錳 過 氧 化 物 酶（manganese peroxidase,MnP）、木質素過氧化物酶（lignin peroxidase,LiP）、多功能過氧化物酶（versatile peroxidase,VP）和染料脫色過氧化物酶（dye-decolorizing peroxidase,DyP）。上述5種木質素降解酶可通過微生物發(fā)酵獲得，主要包括發(fā)酵培養(yǎng)、離心分離、鹽析和有機溶劑分離、凝膠、離子交換和疏水層析以及最后收集步驟。何國斌等[7]采用凍干濃縮、(NH4)2SO4鹽析、Hi Trap phenyl（FF）疏水層析和Q Sepharose Fast Flow 離子交換層析對靈芝EIM-40 發(fā)酵液中的Lac進行分離純化，純化后的Lac 酶活為1511.5U/mg，純化倍數(shù)為14.6 倍，回收率為5.3%。Cai 等[8]采用(NH4)2SO4鹽析、DEAE-纖維素-32 柱和Sephadex G100層析柱對Rhizoctonia sp.SYBC-M3發(fā)酵液中的MnP 進行分離純化，純化后的MnP 酶活為328.1U/mg，純化倍數(shù)12.6 倍，回收率為38.6%。Asgher 等[9]采用(NH4)2SO4鹽析、Sephadex G100 層析柱和DEAE-纖維素柱對Trametes versicolor IBL-04發(fā)酵液中的LiP 進行分離純化，純化后的LiP 酶活為553U/mg，純化倍數(shù)3.3倍，回收率為3.2%。

木質素降解酶被微生物釋放到胞外后，在催化氧化過程中形成自由基進而攻擊木質素。在形成許多具有高度活性的自由基中間體后，通過鏈式反應產(chǎn)生了許多其他類型的自由基，導致木質素分子中主要的化學鍵斷裂形成小分子化合物[10]。在降解過程中，酶活是評判微生物降解木質素能力的重要指標之一，但目前文獻報道的相關酶活測試方法較為多樣[11]，并且受到測試底物、測試條件、非酶促反應和其他物質干擾等影響，這為比較分析來源不同的木質素降解酶造成了一定的困難。為有助于生物法中酶活數(shù)據(jù)的橫向比對，本文對以上5種主要的木質素降解酶的酶活測試方法進行了系統(tǒng)的總結分析，對比了不同測試方法的條件，討論了每個方法的優(yōu)缺點，為生物法降解木質素的相關研究提供借鑒。

1 漆酶

1.1 漆酶的來源、特性及催化機理

圖1 木質素主要結構單體

漆酶（laccase，Lac）最早發(fā)現(xiàn)于漆樹的分泌物中[12]，是一種含銅的多酚氧化酶[13]。目前漆酶已在變色栓菌（Trametes versicolor）[14]和朱紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）[15]等真菌中發(fā)現(xiàn)。Lac 活性中心包括4個銅離子，根據(jù)其光譜學特征可分為3 類：藍型銅（Ⅰ型銅）、常型銅（Ⅱ型銅）和偶聯(lián)雙核型銅（Ⅲ型銅）[16]。銅離子所具有的氧化還原能力使Lac 能夠氧化多種類型的底物，包括酚類、芳香胺類、羧酸類以及相應的衍生物。另外，還可氧化甾體激素、金屬有機化合物、抗壞血酸等非酚類化合物。其中，酚類底物約占底物總量的一半[17]。Lac 可以與幾類介體物質結合共同作用于紫尿酸（violuric acid）等非酚類底物[18]，形成漆酶介體體系（laccase mediator systems，LMS），增強了Lac的氧化還原能力，擴大底物范圍。

在Lac催化氧化反應過程中，底物被氧化生成自由基或醌類物質，氧分子被還原生成水[19]。如圖2所示，Lac催化過程可分為底物作用、電子轉移和中間體被還原等幾個步驟[20]。首先底物被Lac氧化，然后將氧化得到的電子傳遞給氧形成兩個水分子，而氧化后的自由基產(chǎn)物可能參與其他反應形成副產(chǎn)物或者與聚合物發(fā)生降解反應[20]。Lac具有較低的氧化還原電勢（0.5～0.8V），因此只能單獨作用于部分酚類底物，并發(fā)生Cα氧化和Cα—Cβ鍵斷裂反應，而作用于非酚類底物時需要介體[21]。應用LMS后，除氧化Cα和Cα—Cβ鍵外，還可進行環(huán)裂解反應。但是，當2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]和1-羥基-苯并三氮唑（hydroxybenzotriazole，HBT）作為介體時有重聚合反應發(fā)生，說明木質素的生物降解過程是降解反應和重聚合反應的平衡[22]。

圖2 Lac的催化機制［20］

1.2 漆酶酶活測試方法分析

酶活測試的底物類型是決定酶活測試所應用反應類型的關鍵性因素，因此本文主要根據(jù)各種木質素降解酶催化的底物類型進行分類。表1匯總了不同Lac 酶活測試方法，其中ABTS 法應用最廣泛。從表1 中可知，ABTS 法常用的測試波長為420nm[消光系數(shù)ε420=36000L/(mol·cm)]左右。丁香醛連氮（syringaldazine，SGZ）作為底物時，可被氧化脫去羥基形成自由基，然后轉化為粉紅色的醌類化合物[30]， 該 方 法 的 測 試 波 長 為 525nm[ε525=65000L/(mol·cm)]。雖然SGZ是測定Lac酶活最常用的底物，但是由于最終產(chǎn)物醌不溶于水，所以此方法的應用受到限制[31]。2,6-二甲氧基苯酚（2,6-dimethoxyphenol，2,6-DMP）可以作為反應底物，其在Lac的作用下被氧化生成3,5,3′,5′-四甲氧基二苯基醌（3,5,3′,5′-tetramethoxydiphenoquinone,DPQ）[32]。雖然鄰聯(lián)甲苯胺（3,3′-二甲基-4,4′-二氨基聯(lián)苯，3,3′-dimethylbiphenyl-4,4′-diamine）也可作為底物測定Lac酶活，但此方法的相關報道較少，此法在室溫下進行反應時測試波長為600nm[ε600=6340L/(mol·cm)]。此外，愈創(chuàng)木酚（guaiacol）和兒茶酚（鄰苯二酚，catechol）作為底物時，在Lac的作用下，可分別被氧化成醛和半醌自由基[33]，檢測波長為可見光波長。

表1 Lac酶活測試方法匯總

1.3 不同漆酶酶活測試方法比較

通過分析Lac 酶活測試方法可知，2,6-DMP、愈創(chuàng)木酚、SGZ、鄰聯(lián)甲苯胺和兒茶酚等方法測定醌類產(chǎn)物的吸光度隨時間變化曲線時，副反應的存在會導致酶活數(shù)值偏低。而利用ABTS法的催化反應只有一步，即從ABTS 生成ABTS+自由基產(chǎn)物，能夠更加準確地反映實際酶活。此外，應用ABTS作為底物還有其他優(yōu)點：①ABTS 易溶于水、性質穩(wěn)定；②靈敏度較高；③ABTS 沒有毒性或致癌等副作用。但是，ABTS法也常受到其他因素的影響，如ABTS+可以氧化其他分子產(chǎn)生副反應，以及ABTS+的吸光度在一定程度上受ABTS 濃度的影響等，上述因素都會導致酶活數(shù)值偏低。而ABTS價格昂貴、經(jīng)濟適用性不高，這也是該方法的不足之處。相比于ABTS 法，鄰聯(lián)甲苯胺屬于有毒致癌物，且水溶性較差，作為底物測得的酶活力較低；愈創(chuàng)木酚在Lac作用下生成的產(chǎn)物相對穩(wěn)定，但反應時間長；SGZ 的消光系數(shù)較大，有較高的靈敏度，但底物本身有刺激性，反應濃度過高時反應穩(wěn)定性差。綜上，ABTS 法可作為測定Lac 酶活的合適方法。

2 錳過氧化物酶

2.1 錳過氧化物酶的來源、特性及催化機理

錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）屬于一種糖基化胞外過氧化物酶，首次發(fā)現(xiàn)于白腐真菌黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）中[34]，主要以含乙烯基和酚基類化合物為底物，尤其是含丁香酚基的底物[35-36]。在H2O2和有機酸存在的條件下，MnP 與有機酸進一步結合作用于底物，如愈創(chuàng)木酚、2,6-DMP和酚紅等。

MnP的催化循環(huán)如圖3所示，由于H2O2分子中氧原子具有強電負性，MnP分子中亞鐵血紅素上的雙電子首先遷移到氧氧鍵上，MnP被氧化成活性氧絡合四價鐵卟啉聯(lián)合體（MnP化合物1）[38]。然后，Mn2+失去一個電子，MnP化合物1被還原為MnP化合物2。最后，MnP 化合物2 通過單電子轉移途徑被還原成初始狀態(tài)。但當H2O2過量時，MnP 化合物2容易被氧化失去活性[38]。

圖3 MnP的催化機理示意圖［37］

當Mn2+被氧化成Mn3+后，由于Mn3+也可能會與MnP結合，從而失去氧化能力，所以需要加入螯合劑生成高氧化還原電勢的螯合物，進一步氧化木質素類底物。螯合劑的優(yōu)點：①促進Mn3+與酶的分離；②使Mn3+更穩(wěn)定；③促進游離的Mn2+與酶的結合[39]。有機酸如乳酸、酒石酸、丙二酸和草酸等是常見的螯合劑。如圖4所示，Mn3+和有機酸的螯合物能與多種底物發(fā)生單電子氧化反應，例如酚類底物和芳香胺類底物被氧化脫氫后所生成的自由基產(chǎn)物[38]。此外，如蒽、菲和芘等芳香族有機物亦可被氧化，其中苯環(huán)可被氧化成芳香環(huán)正離子自由基[40]。脂肪酸和硫醇能被氧化脫氫生成對應的自由基產(chǎn)物。這些自由基產(chǎn)物能和氧分子反應生成過氧化物[38]，從而切斷木質素中鍵能較高的化學鍵。在氧化過程中，由于木質素分子較大，只能氧化邊緣結構，很難滲透到分子中。但是，當利用螯合物為介體時，分子內部酚類結構也可參與反應，包括Cα—Cβ鍵斷裂、Cα氧化和芳基-烷基C—C鍵斷裂等反應。此外在酚類介體（如藜蘆醇）和不飽和脂肪酸（如油酸或亞麻油酸）的存在下，MnP的底物范圍得到擴展，包括氧化木質素分子中的非酚類結構β—O—4 鍵、C—C 鍵和β-芳基醚鍵等，從而生成香草醛和原兒茶酸等小分子物質[21,38]。

圖4 MnP與不同底物的作用示意圖［38］

2.2 錳過氧化物酶酶活測試方法分析

在測定MnP酶活的方法中，錳離子（Mn2+）法最為常見并被普遍使用。根據(jù)測定錳過氧化物酶酶活底物的不同進行分類，表2 匯總了不同MnP酶活測試方法。由表2 可知，當Mn2+法反應體系采用乳酸鈉緩沖溶液時所用波長為240nm，而采用丙二酸鈉緩沖溶液時為270nm。這主要是因為丙二酸與Mn3+形成的螯合物在270nm 處消光系數(shù)達到最大值[ε270=11590L/(mol·cm)]，而乳酸鈉螯合物最大值在240nm 處[ε240=6500L/(mol·cm)]。Mn3+和丙二酸形成螯合物的消光系數(shù)更大，因此其他條件不變的情況下，利用丙二酸作為緩沖液時對底物濃度變化更靈敏。所以，選擇丙二酸緩沖溶液更適合Mn2+法。

表2 MnP酶活測試方法匯總

如圖5 所示，愈創(chuàng)木酚（C7H8O2）可以在MnP和Mn2+的共同作用下被氧化生成四鄰甲氧基連酚[45]。 愈 創(chuàng) 木 酚 在470nm 處 的 消 光 系 數(shù)ε470=6650L/(mol·cm)[53]，四鄰甲氧基連酚在465nm處的消光系數(shù)ε465=12100L/(mol·cm)[46]，所以在保持測定MnP活性的pH（pH=4）為最適的條件下，通過在465nm處測定產(chǎn)物四鄰甲氧基連酚的吸光度變化計算得到的酶活數(shù)值更加精確。

圖5 MnP催化愈創(chuàng)木酚氧化反應［52］

MnP可以氧化多種有機染料，包括酚紅、次甲基藍和甲基橙等[54-55]。其中酚紅[分子式C19H14O5S，消光系數(shù)ε610=22000L/(mol·cm)]與2,6-DMP 均可用于測定酶活[56]。如圖6 所示，MnP 催化氧化2,6-DMP 時，MnP 先與H2O2作用將Mn2+氧化為Mn3+而非直接作用于2,6-DMP。隨后Mn3+氧化2,6-DMP 生成醌類自由基，Mn3+被還原成Mn2+，完成一個循環(huán)。醌類中間體反應生成二聚體，其后被Mn3+氧化生成最終產(chǎn)物醌二聚物。此二聚物最大吸收波長位于469nm 處， 消光系數(shù)ε469=49600L/(mol·cm)。由上述機理可知，每生成1mol醌二聚物需要消耗4mol Mn3+。據(jù)報道，Mn3+可以和H2O2發(fā)生反應生成H2O、O2和Mn2+，但Mn3+更傾向與酚類底物反應，所以在此反應過程中Mn3+和2,6-DMP 的反應為主反應，而與H2O2的反應為副反應[51]。

圖6 MnP催化氧化2，6-DMP機理［51］

2.3 不同錳過氧化物酶酶活測試方法比較

在上述方法中，除了Mn2+法是MnP 直接作用于底物外，其余方法都是MnP 間接作用于底物。采用Mn2+氧化法時，不同螯合物需在不同的波長下測定吸光度的變化。相比于Mn3+螯合物，酚類底物更加穩(wěn)定。愈創(chuàng)木酚是一種木質素單體模型化合物，所以在測定MnP 活性時，采取愈創(chuàng)木酚作為底物更加合適。當用酚紅法測試MnP活性時，反應體系中須加入明膠和NaOH，步驟較為繁瑣。此外，由于2,6-DMP 法消光系數(shù)較大，反應較為靈敏，同時2,6-DMP 也是一種類木質素單體化合物，對木質素降解機理的研究有一定幫助。綜上，2,6-DMP法較適用于測定MnP酶活。

3 木質素過氧化物酶

3.1 木質素過氧化物酶的來源、特性及催化機理

木質素過氧化物酶（lignin peroxidase,LiP）是一種含有亞鐵血紅素的過氧化物酶，可以催化包括各類多環(huán)芳香族化合物在內的多種底物[57]。目前已報道黃孢原毛平革 菌 （Phanerochaete chrysosporium）[58]、 采 絨 革 蓋 菌 （Coriolus versicolor）[59]、綠色糖單孢菌（Saccharomonospora viridis）[60]和樺革褶菌（Lenzites betulina）[61]等真菌均可以分泌LiP。

如圖7 所示，在催化循環(huán)過程中，LiP 為H2O2提供自由電子，自身失去兩個電子被氧化為LiP Ⅰ。LiP Ⅰ再從底物得到1 個電子形成LiP Ⅱ，后者進一步被還原為LiP。在還原LiP 的同時，底物也被氧化為其他物質[62]。LiP 具有很高的氧化還原電勢，通過形成木質素陽離子基團使木質素的活性提高，達到降解酚類和非酚類木質素化合物的目的。對于酚類底物可以發(fā)生Cα—Cβ鍵斷裂和去甲基化反應；對于非酚類底物則可以發(fā)生芐基亞甲基的羥基化、芐基醇氧化反應和斷裂β—O—4鍵[21,63]。

圖7 LiP的催化機理［62］

3.2 不同木質素過氧化物酶酶活測試方法的分析及比較

根據(jù)測定木質素過氧化物酶酶活底物的不同進行分類，表3 匯總了測定LiP 酶活最常見的2 種方法：藜蘆醇法和天青染料B 法。藜蘆醇（veratryl alcohol,VA）分子式為C9H12O3，是常見的木質素單體模型化合物。在LiP 的催化作用下，VA 被氧化為藜蘆醛，溶液由無色變?yōu)樘焖{色，其消光系數(shù)在310nm 處最大[ε310=9300L/(mol·cm)][67-68]。天青染料B（azure B）在LiP 的催化作用下被氧化為天青B自由基，溶液由深藍色變?yōu)闊o色，在651nm處達到最大吸光度[66,69]。由表3可知，藜蘆醇法測LiP酶活最少可在3min 內測定，而天青B 法最少需要20min。從反應動力學分析，LiP 對藜蘆醇有較小的Km和較高的Vmax，所以所需時間較短，降低了由于酶活性降低而影響準確率的可能性。然而，與310nm相比，木質素造紙廢水、多酚和含醌樣品中的干擾物質在651nm處的消光系數(shù)很小，因此對天青B法干擾較小。綜上所述，當被測溶液中干擾物質較少或對檢測效率要求較高時，藜蘆醇法較適合，相反當干擾物質多且檢測時間寬裕時可選用天青B法。

表3 LiP酶活測試方法匯總

4 多功能過氧化物酶

4.1 多功能過氧化物酶的來源、特性及催化機理

多功能過氧化物酶（versatile peroxidase, VP）在白腐真菌刺芹側耳（Pleurotus eryngii）[70]、亞黑管 菌 （Bjerkandera fumosa）[71]和 亞 臥 孔 菌（Physisporinus vitreus）[72]中均有發(fā)現(xiàn)。VP 具有多個血紅素輔基的氧化結合位點及Mn2+結合位點，其作用底物廣泛，包括：①LiP 作用的底物，如藜蘆醇（VA）；②MnP作用的底物，如2,6-DMP和Mn2+等；③一些簡單的類木質素單體酚類化合物；④不能被LiP 和MnP 直接氧化的非酚類底物，如多環(huán)芳香烴等。

圖8 VP的催化機理［73］

4.2 不同多功能過氧化物酶酶活測試方法的分析及比較

VP 結合了LiP 和MnP 的特性，能催化多種底物包括ABTS、2,6-DMP、錳離子和酚紅等。根據(jù)測定多功能過氧化物酶酶活底物的不同進行分類，表4匯總了不同VP酶活測試方法。由表4可知，當采用Mn2+法測定VP 活性時，檢測波長為238nm，消光系數(shù)ε238=6500L/(mol·cm)[79]。通常ABTS法底物濃度為0.1～5mmol/L，在加入H2O2后，ABTS被催化轉化生成ABTS 自由基，在420nm 或者436nm 處測定ABTS自由基的吸光度隨時間的變化，消光系數(shù)ε420=36000L/(mol·cm)[74]和ε436=29300L/(mol·cm)[76]。酚紅法的底物濃度為0.1g/L（0.28mmol/L），檢測波長610nm，消光系數(shù)ε610=22000L/(mol·cm)[78]，此法相關報道較少。在上述三種方法中，ABTS 法的消光系數(shù)最大，靈敏度較高，酚紅法次之，Mn2+法最小。此外，ABTS 法生成的產(chǎn)物更加穩(wěn)定，在一定程度上可減少測試誤差。綜上，ABTS 法可作為測定VP酶活的合適方法。

表4 VP酶活測試方法匯總

5 染料脫色過氧化物酶

5.1 染料脫色過氧化物酶的來源、特性及催化機理

染料脫色過氧化物酶（dye-decolorizing peroxidase, DyP）能氧化多種染料如蒽醌類染料、活性藍5 和活性藍19 等。過氧化物酶數(shù)據(jù)庫（peroxidase database）將血紅素過氧化物酶分為5大家族，其中DyP 屬于染料脫色過氧化物酶超家族[80]。目前，DyP 已經(jīng)于鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）[81]、 嗜 熱 單 孢 菌 （Thermobifida fusca）[82]和 熒 光 假 單 胞 菌 （Pseudomonas fluorescens）[83]等多種微生物中發(fā)現(xiàn)。如圖9 所示，在DyP 的催化氧化反應開始前，酶（E）和H2O2存在一個平衡狀態(tài)，形成一個前體復合物E-H2O2；第二步轉化為化合物Ⅰ，并且H2O2中O—O鍵斷裂生成水，此過程不可逆。在一定的pH 范圍內，化合物Ⅰ生成速率隨著pH 的增加而增加。隨后化合物Ⅰ與底物反應生成化合物Ⅱ和自由基產(chǎn)物，其反應速率與H2O2的濃度無關。最后，在化合物Ⅱ與底物反應生成E的過程中存在一個預平衡狀態(tài)，即化合物Ⅱ-AH。整個反應過程的限速步驟是化合物Ⅱ-AH轉化為E的過程[84]。據(jù)報道，來源于真菌的DyP比細菌DyP活性高，并能在酸性條件下催化多種底物。氧化還原介體如Mn2+和藜蘆醇等會促進DyP的降解反應。DyP降解木質素過程中可發(fā)生脫羧、Cα—Cβ鍵和β—O—4鍵斷裂等反應[85]。

圖9 DyP催化機理圖［84］

5.2 不同染料脫色過氧化物酶酶活測試方法的分析及比較

根據(jù)測定染料脫色過氧化物酶酶活底物的不同進行分類，表5總結了不同DyP酶活測試方法。其中，ABTS 法檢測波長為420nm，消光系數(shù)ε420=36000L/(mol·cm)[86]。藜蘆醇法檢測波長為340nm或310nm，消光系數(shù)ε310=9300L/(mol·cm)[86,88]?；钚运{5（reactive blue 5，RB5）是一種用于絲綢和錦綸纖維等材料染色的常見染料，分子式是C29H17ClN7Na3O11S3。在酶作用下，RB5 轉化為2,2′-二磺?；嫉?、鄰苯二甲酸酯和3-[(4-氨基-6-氯-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]苯[91]，檢測波長為600nm，消光系數(shù)ε600=800L/(mol·cm)[92]。 活 性 藍19 （reactive blue 19,RB19）具有較高的染色效率，所以被廣泛使用于棉和麻等纖維材料的染色，其分子式為C22H16N2Na2O11S3，RB19 法 在595nm 處 的 消 光 系 數(shù) 為ε595=10000L/(mol·cm)[86]。除上述三種方法可用于測定DyP 酶活外，據(jù)報道另有愈創(chuàng)木酚法、2,6-DMP法、活性藍4 法和活性紅120 法等多種方法。在上述三種方法中，ABTS 法的消光系數(shù)最大，靈敏度較高，并且生成的產(chǎn)物比較穩(wěn)定，無副反應，測量誤差較小，測得的酶活數(shù)據(jù)更加準確，而RB5和RB19 法存在催化效率較低和性質不穩(wěn)定等問題。綜上，在對酶活測試精度及速度要求較高且經(jīng)濟寬裕的條件下，ABTS 法較適合于DyP 酶活的測定。

表5 DyP酶活測試方法匯總

6 結語

近年來，隨著環(huán)境、能源問題的日益突出，可持續(xù)發(fā)展已成為未來社會的發(fā)展趨勢[93]。其中，以生物質為代表的可再生資源，是解決能源問題的重要途徑。木質素作為生物質的一大種類，是自然界中儲量豐富的可再生芳香族聚合物。近年來關于木質素生物降解的研究成為熱點，包括木質素的分離、有效表征和合理定向轉化等研究方向。生物法可以通過多種代謝途徑降解木質素，產(chǎn)生的高附加值產(chǎn)物較為多樣，具有很高的實用價值和社會意義。目前木質素生物降解的應用并不多見，但在某些方面已經(jīng)體現(xiàn)出良好前景，如用于造紙工業(yè)的生物漂白、生物脫色和廢水處理，轉化生成乙醇等生物燃料和環(huán)境保護及土壤修復等方面。

在木質素的生物降解過程中，木質素降解酶發(fā)揮著重要的作用。酶活可以為微生物對木質素的降解能力提供重要的參考和對比，也是木質素降解機理研究的重要工具。但是由于酶活測試方法的多樣性，導致文獻間數(shù)據(jù)對比困難，難以對研究結果進行橫向評價與衡量。目前木質素降解酶的酶活測試存在的主要挑戰(zhàn)有以下兩方面。

（1）酶活測試底物多樣化

測定同一種木質素降解酶的酶活可利用其對多種底物的生物催化反應。例如，Lac可通過催化轉化ABTS、SGZ、鄰聯(lián)甲苯胺、愈創(chuàng)木酚和兒茶酚等多個底物的反應測定酶活，但是由于Lac對不同底物的親和力和反應速率不同，因此造成測得的酶活數(shù)值難以橫向比較。

（2）酶活測試條件差異較大

當選定一種底物測定酶活時，由于在測試過程中采用的條件不同也會導致酶活數(shù)值具有差異性。例如：緩沖溶液的pH、反應體系的溫度和測試波長等條件會對最終酶活數(shù)值有較大影響。當采用ABTS 法測定VP 活性時，對于產(chǎn)物ABTS 自由基，測試波長可采用420nm或436nm，其消光系數(shù)分別為ε420=36000L/(mol·cm)和ε436=29300L/(mol·cm)，導致測得的酶活數(shù)值存在差異。

本文通過比較分析為每種酶的酶活測試推薦了較適方法，若能在一定條件下使用推薦方法，則可以解決酶活測試底物多樣化和條件差異大的問題。ABTS 法因反應靈敏、測試效率高、副反應少且性質穩(wěn)定等優(yōu)點，可作為測定Lac、VP以及DyP酶活的合適方法。若能通過優(yōu)化ABTS測試所需濃度并將ABTS溶液在低溫密封環(huán)境中保存，以及對木質素降解酶進行提純，則能在一定程度上避免ABTS法存在的問題。2,6-DMP法由于測試靈敏度高且屬于類木質素單體，因此適合用于MnP 酶活測定。LiP 推薦結合使用藜蘆醇法和天青B 法，具體情況由被測溶液中干擾物質的量以及對檢測效率的要求決定。其他方法如SGZ法、鄰聯(lián)甲苯胺法、愈創(chuàng)木酚法、兒茶酚法、Mn2+法、酚紅法和活性藍法等各具特色，可以作為木質素降解酶的酶活測試輔助方法。綜上所述，本文通過系統(tǒng)性的分析、比較和評價主要木質素降解酶的酶活測試反應機理和測試方法，為木質素降解酶研究中存在的問題提供了解決方案，為未來生物法降解木質素的研究奠定了堅實的基礎。