基于TGF-β1/p38MAPK/FN信號(hào)通路的放射性食管炎發(fā)病機(jī)制的研究

張福鵬 ，趙曉燕，郝淑蘭，樊桂玲，李曉麗，王愛榮，劉麗坤

0 引言

放射性食管炎（radiation esophagitis,RE）是惡性胸部腫瘤（如食管癌、中央型肺癌等）在放射治療中常見的局部不良反應(yīng)，多數(shù)為急性，發(fā)生率為10%～20%，且與照射劑量密切相關(guān)[1-2]。目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要從應(yīng)激反應(yīng)及炎性細(xì)胞因子等方面進(jìn)行闡述[1]，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和白細(xì)胞介素-8（interleukin-8,IL-8）等不良反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子是研究的熱點(diǎn)[3-5]。

然而，放射性食管炎是自限性并發(fā)癥，黏膜修復(fù)是其恢復(fù)的重要環(huán)節(jié)[6]，而纖維粘連蛋白（fibronectin,FN）主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）中，作為黏膜修復(fù)主要的蛋白因子參與黏膜修復(fù)，在促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化等方面發(fā)揮著重要的作用，具有促進(jìn)細(xì)胞再生與修復(fù)的生物學(xué)功能[7]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是啟動(dòng)和終止細(xì)胞修復(fù)的重要因子，與FN共同調(diào)節(jié)著黏膜組織修復(fù)[8]，并且黏膜修復(fù)與纖維化在組織恢復(fù)過程中同時(shí)發(fā)生，TGF-β1/促分裂素原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路是腎臟纖維化、心肌纖維化過程中重要的信號(hào)通路[9-10]，p38MAPK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)FN的產(chǎn)生，從而促進(jìn)黏膜快速修復(fù)。

本研究通過建立Sprague-Dawley（SD）大鼠放射性食管炎模型，探討TGF-β1/p38MAPK/FN信號(hào)通路是否介導(dǎo)RE的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及造模

本研究所選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為20只成年雌性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究所（許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004），于山西省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心喂養(yǎng)，大鼠生長環(huán)境為（23±1）℃、濕度75%。本研究經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

根據(jù)文獻(xiàn)[11]及預(yù)實(shí)驗(yàn)給予造模，采用單次照射，劑量為40 Gy，皮源距100 cm，照射范圍為食管上端，劍突上3 cm。應(yīng)用山西省中醫(yī)院腫瘤科放療中心的美國Varian（瓦里安）直線加速器6MV-X，劑量率為340 Mu/min。

1.2 試劑與材料

TIANScript RT Kit，SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）購自天根生物科技有限公司，蛋白酶抑制劑購自美國Roche公司（04693116001）；一抗：TGF-β1、p38MAPK、FN；二抗：山羊抗兔IgG（H+L）HRP Jackson 111-035-003、山羊抗鼠IgG（H+L）HRP Jackson 115-035-003均購自中國Abcam公司。

輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（RM2235，美國Leica公司），ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司），多功能高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（FluorChemHD2，美國Alpha公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 分組及生理活動(dòng)觀察 實(shí)驗(yàn)共分5組：對(duì)照組（未行照射）、一周組（放射性食管炎SD大鼠模型第一周殺減組）、二周組（放射性食管炎SD大鼠模型第二周殺減組）、三周組（放射性食管炎SD大鼠模型第三周殺減組）和四周組（放射性食管炎SD大鼠模型第四周殺減組）。每日記錄各組體質(zhì)量、水和食物攝入量。

1.3.2 病理檢測 按照分組情況進(jìn)行殺減，將食管樣本縱向解剖，用10%甲醛溶液固定并儲(chǔ)存于-80℃冰箱中。經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，HE染色切片，顯微鏡下觀察各組食管組織的病理變化。

1.3.3 Real-time PCR法檢測放射性食管炎SD大鼠模型食管TGF-β1、FN mRNA表達(dá) 用超純RNA提取試劑（TaKaRa Code D9108B）提取組織樣本中總RNA。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)相對(duì)定量分析。目的基因引物及探針，見表1。

表1 目的基因引物及探針Table 1 Target gene primers and probes

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測放射性食管炎SD模型TGF-β1、p38MAPK和FN蛋白表達(dá) 預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑提取蛋白。濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓120 V，通過預(yù)染蛋白Marker確定電泳停止時(shí)間。300 mA恒流；0.45 μm孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90 min。轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。將膜完全浸沒于5%BSATBST中，水平搖床孵育1 h（RT）封閉。

加入一抗，5%BSA-TBST稀釋一抗（稀釋比例1:1000），4℃水平搖床孵育過夜。加入二抗，5%BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔及山羊抗鼠IgG（H+L）HRP 1:10000，室溫孵育40 min。膜蛋白面滴加ECL，反應(yīng)3 min；膠片曝光10 s～5 min（曝光時(shí)間隨光強(qiáng)度不同而調(diào)整），顯影2 min，定影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。單因素方差分析比較各組數(shù)據(jù)，當(dāng)方差齊時(shí)使用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)使用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放射性食管炎SD大鼠模型進(jìn)食量、進(jìn)水量及體質(zhì)量的變化

放射治療后一周造模組進(jìn)水量、進(jìn)食量及體質(zhì)量較對(duì)照組明顯下降（P=0.000），大鼠煩躁明顯，頸部開始脫毛。從第三周起，大鼠進(jìn)水量、進(jìn)食量及體質(zhì)量逐漸恢復(fù)，見圖1。

圖1 SD大鼠進(jìn)水、進(jìn)食量及體質(zhì)量的動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Dynamic changes of water intake,food intake and body weight of SD rats

2.2 放射性食管炎SD大鼠模型食管病理的動(dòng)態(tài)變化

第一、二周組食管黏膜上皮中重度破壞，鱗狀上皮層、棘細(xì)胞層、基底細(xì)胞層壞死脫落，第二周組肌層炎性細(xì)胞明顯浸潤，第三周組黏膜上皮開始恢復(fù)，第四周組黏膜上皮基本恢復(fù)到正常，見圖2。

2.3 放射性食管炎SD大鼠模型食管組織FN、TGF-β1基因的表達(dá)

Real-time PCR法檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，F(xiàn)N mRNA表達(dá)水平放射后迅速下降，第二、三、四周逐漸上升，至第四周基本恢復(fù)至正常水平，而TGF-β1 mRNA表達(dá)水平在放射損傷后上升，隨著放射時(shí)間的推移，其表達(dá)逐漸下降至正常水平，見表2。

表2 放射性食管炎SD大鼠模型食管組織FN、TGF-β1 mRNA的表達(dá)Table 2 Expression of FN and TGF-β1 mRNA in esophagus tissue of SD rat model of radiation esophagitis

食管組織中FN、P38和TGF-β1蛋白的表達(dá)，見圖3。第一周FN蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下降（P=0.000），而第三周期逐漸恢復(fù)，第四周已與對(duì)照組無顯著差異（P=0.100）；TGF-β1蛋白表達(dá)第一周較對(duì)照組升高（P=0.000002），從第二周開始降低，第四周與對(duì)照組無明顯差異（P=0.136），而P38蛋白表達(dá)亦從第一周開始上升（P=0.000），隨著時(shí)間的推移逐漸下降。

3 討論

既往臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示在諸多纖維化的疾病模型中都出現(xiàn)TGF-β1、p38MAPK高表達(dá)[12-13]，尤其在γ線照射后TGF-β1升高，激活p38MAPK信號(hào)通路[14]，p38MAPK的激活可以促進(jìn)因子TGF-β1的產(chǎn)生和激活，同時(shí)由于TGF-β1的異常升高可以增加p38MAPK的磷酸化水平并進(jìn)一步激活p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[15]。例如在腎纖維化過程中，p38MAPK通路的激活誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)ECM（extracellular matrix,ECM）大量合成，p38MAPK通路是細(xì)胞將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞到核的主要通路。在腎纖維化形成過程中，磷酸化的p38MAPK（p-p38MAPK）可結(jié)合FN啟動(dòng)子，促進(jìn)FN轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)膠原合成增加及腎小球基底膜增厚、ECM積聚[16]，從而使FN產(chǎn)生增加[17]，同時(shí)p38MAPK又可通過與TGF-β1相互調(diào)節(jié)以及基質(zhì)金屬蛋白酶活性及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)等多種途徑影響FN的生成，提示TGF-β1、p38MAPK廣泛參與生成ECM的生理和病理過程中。TGF-β1激活p38MAPK的一般過程：TGF-β1先以高親和力與TGF-β1配體結(jié)合，再與TAB1結(jié)合形成異二聚體，TAK1將TGF-β1二聚體近膜區(qū)的絲氨酸和甘氨酸殘基GS功能域磷酸化，從而激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?；罨氖荏w激活MAPK，啟動(dòng)p38MAPK信號(hào)通路[18]。

圖2 放射性食管炎SD模型食管病理的動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Dynamic pathological changes of esophagus in SD model of radiation esophagitis

圖3 放射性食管炎SD大鼠模型食管組織FN(A)、TGF-β1(B)和P38(C)蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of FN(A),TGF-β1(B) and P38(C) protein in esophagus tissue of SD rat model of radiation esophagitis

食管壁分為四層：黏膜層、黏膜下層、肌層和外層（纖維層）。黏膜表層由鱗狀上皮組成[19]，本研究通過觀察組織病理變化發(fā)現(xiàn)，放射性食管炎發(fā)生后，第一周黏膜上皮輕度壞死脫落，基底層輕微破壞，第二周、第三周黏膜上皮重度破壞，甚至全層脫落，炎性細(xì)胞浸潤肌層，基底層脫落，第四周黏膜層逐漸新生、恢復(fù)。由此可見，放射性食管炎是自限性，但需要三至四周時(shí)間，且往往在過程中因合并出血、穿孔等癥狀中斷治療。

綜上所述，放射性食管炎發(fā)生后，TGF-β1上升，激活p38MAPK通路，誘導(dǎo)食管ECM合成，F(xiàn)N產(chǎn)生增加，從而促進(jìn)了食管黏膜的恢復(fù)。TGF-β1/p38MAPK/FN通路可能從黏膜修復(fù)角度解釋了放射性食管炎的發(fā)病機(jī)制。