新型根管充填材料HiFlow的體外細胞毒性研究

戴怡茹 楊健

根管治療經(jīng)過預(yù)備和消毒，根管內(nèi)仍可能存有病原微生物，根管充填是根管治療的重要步驟，其最終目標是以生物相容性良好的材料嚴密充填根管，封閉根尖孔，占據(jù)病原微生物可能存在的空腔[1]。目前，臨床上常用的根管充填材料為核材料和根管封閉劑[2]。根管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，根管封閉劑的使用至關(guān)重要[3]。理想的根管充填材料不僅要有長久的封閉性、體積穩(wěn)定不收縮、一定的抗菌作用、X線阻射性和不使牙變色等特點，同時要具有良好的生物相容性[4]。目前臨床常用的根管封閉劑按其成分可分為：氧化鋅丁香油類、氫氧化鈣類、樹脂類和近年來以iRoot?SP為代表的生物陶瓷類。以 iRoot?SP為代表的生物陶瓷類根管封閉劑具有良好的抗菌性、根尖封閉性和生物相容性[5-6]，由于iRoot?SP 封閉劑的最佳加熱溫度尚無明確定論，產(chǎn)品說明書推薦使用單尖充填技術(shù)。EndoSequence?BC SealerTMHiFlow(HiFlow,Brasseler USA, 美國)是Brasseler USA公司專為使用熱牙膠垂直加壓充填法而設(shè)計的一種新型生物陶瓷類根管封閉劑。目前還沒有關(guān)于HiFlow生物相容性的相關(guān)研究。本研究采用CCK-8法對比HiFlow、AH Plus、iRoot?SP、MTA 4 種根充材料對L929細胞的細胞毒性，評價HiFlow對L929細胞的細胞毒性作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

HiFlow(Brasseler USA，美國)；AH Plus、MTA(Dentsply，德國)；iRoot?SP(Innovative Bioceramix Inc，加拿大)；L929細胞(南昌大學(xué)公衛(wèi)實驗室饋贈)；胎牛血清(四季青)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Solarbio)；胰蛋白酶、CCK-8試劑盒(TransGen Biotech)；細胞計數(shù)板(QIUJING)；超凈臺(AIRTECH)；恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、濕度95%、含5%CO2)(Thermo，德國)；倒置相差顯微鏡(Optec)；酶標儀(PerkinElmer，EnSpire，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將L929細胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞長滿培養(yǎng)瓶底約80%～90%后用胰蛋白酶消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至3～4 代。

1.3 浸提液制備

在無菌條件下將HiFlow、調(diào)和的AH Plus、iRoot?SP、調(diào)和的MTA置于模具中制成直徑約5 mm，厚度約2 mm的圓片樣本，每組根管充填材料制備4 個樣本，置于培養(yǎng)箱內(nèi)固化24 h。固化后的每組樣本分別加入1 ml浸提介質(zhì)(含10%胎牛血清的L929細胞培養(yǎng)基)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后取出樣本。浸提液用于CCK-8實驗。

1.4 CCK-8實驗

取處于對數(shù)生長期末的第3～4代細胞，用胰蛋白酶消化分散，使用細胞計數(shù)儀調(diào)整細胞密度為5×104個/ml，取24 孔板1塊，以1 ml/孔接種細胞懸液，分別測定24、48、72、96、120 h細胞數(shù)目，每時段設(shè)4 個復(fù)孔，取均值繪制L929細胞生長代謝曲線。取96 孔板3 塊，以100 μl/孔接種細胞懸液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24 h。鏡下觀察細胞貼壁后，棄液。在A組、B組、C組、D組分別加入100 μl各組樣本浸提液至相應(yīng)細胞培養(yǎng)孔中，E組(正常對照組)加100 μl細胞培養(yǎng)基，每組設(shè)4 個復(fù)孔，分別置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12、24、48 h后各取1 板，棄液，每孔加入100 μl細胞培養(yǎng)基和10 μl CCK-8試劑混合液，另設(shè)置4 孔為F組(空白組)：加入100 μl細胞培養(yǎng)基和10 μl CCK-8試劑混合液。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。用酶標儀測定各實驗組在450 nm處的吸光度，計算細胞相對增殖率。

1.5 細胞鑒定

各組根充材料浸提液培養(yǎng)L929細胞，分別于12、24、48 h后倒置顯微鏡觀察細胞狀態(tài)，并隨機拍照記錄48 h細胞形態(tài)變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有檢測均由一名輔助人員盲法完成，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，雙側(cè)檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 L929細胞生長曲線

72 h后，細胞增殖明顯減緩(圖 1)。

圖 1 L929細胞生長代謝曲線

表 1 各組根充材料浸提液培養(yǎng)L929細胞12、24、48 h的A值

2.2 CCK-8實驗

各組根充材料浸提液培養(yǎng)L929細胞12、24、48 h A值比較見表 1。不同根充材料浸提液培養(yǎng)L929細胞12、24、48 h細胞毒性總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中B組與A組、C組、D組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；12、24和48 h A組、C組和D組差異差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

各組根充材料浸提液培養(yǎng)L929細胞12、24、48 h細胞相對增殖率均值比較見圖 2。

2.3 各組樣本浸提液培養(yǎng)的L929細胞形態(tài)改變

培養(yǎng)48 h后倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變，結(jié)果如圖 3。E組細胞為正常長梭形、多角形，牢固地粘附于培養(yǎng)皿底，排列較密集，折光性強，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰。A組、C組和D組細胞形態(tài)呈長梭形、多角形，牢固貼壁于培養(yǎng)皿底，排列較密集，折光性較強，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰。B組部分細胞形態(tài)改變?yōu)榍蛐?，部分細胞懸浮不貼壁，細胞數(shù)目較少，部分細胞出現(xiàn)核皺縮，部分細胞結(jié)構(gòu)破壞有細胞碎片。

圖 2 各組根充材料浸提液培養(yǎng)L929細胞12、24、48 h的細胞相對增殖率

圖 3 L929細胞與各根充材料浸提液培養(yǎng)48 h的細胞形態(tài)(相差顯微鏡, ×200)

3 討 論

由于根管峽部、側(cè)支根管、根尖分歧等不規(guī)則區(qū)域的存在，根管解剖形態(tài)復(fù)雜，單純核材料無法嚴密充填根管而導(dǎo)致根尖微滲漏的機會增加，根管封閉劑與核材料結(jié)合使用可獲得嚴密的三維效果的充填，因此根管封閉劑在根管充填過程中發(fā)揮著重要作用。在根管充填過程中，尤其是使用熱牙膠垂直加壓充填法，根管封閉劑容易被推出根尖孔，與根尖周組織直接接觸，其毒性作用的大小直接影響根尖周組織建立有利于愈合修復(fù)的環(huán)境。Oztan等[7]研究顯示根管封閉劑材料固化過程中會釋放物質(zhì)至根尖周組織，Meryon[8]報道釋放物質(zhì)的量與材料表面積相關(guān)聯(lián)。另外有研究[9]表明材料的釋放物質(zhì)可以用材料的浸提液來表示，而浸提液的細胞毒性即可模擬根管封閉劑固化過程中釋放的物質(zhì)對根尖周組織的毒性作用。根據(jù)以上結(jié)果，本實驗按照ISO 10993-5：1999標準制備浸提液用于比較HiFlow、AH Plus、iRoot?SP、MTA的生物相容性。

細胞毒性實驗具有敏感性高、簡便和研究周期短等優(yōu)點，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)色法(MTT法)是最早使用檢測材料的細胞毒性的比色法，Cell Counting Kit-8比色法(簡稱CCK-8法)為MTT法的替代法，兩者原理相同：將活細胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成甲臜，通過甲臜數(shù)量的檢測就可以反映細胞的活性，不同在于MTT法甲臜產(chǎn)物不溶于水，檢測需先用有機溶劑溶解，對細胞毒性高，而CCK-8法甲臜產(chǎn)物是水溶性的，對細胞基本無毒性，實驗操作步驟少、周期短，能有效地減少實驗過程中的污染，實驗結(jié)果更加靈敏和穩(wěn)定[10-11]。因L929細胞易獲得、易存活且傳代周期短，在細胞毒性實驗中應(yīng)用廣泛。故本實驗本研究采用CCK-8法評價HiFlow對L929細胞的細胞毒性。

CCK-8法顯示各組根充材料浸提液培養(yǎng)L929細胞12、24、48 h A值均顯示AH Plus的細胞毒性較HiFlow、iRoot?SP、MTA大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這和以往將AH Plus的細胞毒性與MTA對比的研究結(jié)果一致，原因是AH Plus的主要成分是四氮六甲環(huán)和二甲酚A二環(huán)氧丙酯醚，A劑和B劑混合后四氮六甲環(huán)在水溶液環(huán)境中會分解為甲醛和胺，甲醛通過激活I(lǐng)L-6和IL-8基因的表達引起細胞變態(tài)反應(yīng)使之存在一定的細胞毒性[12-14]。 HiFlow和iRoot?SP、MTA的細胞毒性類似，其12、24、48 h A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。MTA的主要成分為硅酸鹽水泥，反應(yīng)產(chǎn)物硅酸鈣水合物(C-S-H)和氫氧化鈣釋放的Ca2+使其不論是對細胞還是骨均有良好的生物相容性，亦可促進成骨的發(fā)生，因此MTA的細胞毒性通常作為評價根充材料生物相容性的金標準[15-16]。iRoot?SP的主要成分為硅酸鈣、磷酸鈣、氫氧化鈣等，磷酸鈣和氫氧化鈣反應(yīng)產(chǎn)生羥基磷灰石和水，水促進硅酸鈣水化反應(yīng)生成C-S-H和氫氧化鈣，在細胞容相性、組織相容性等方面均具有與MTA相當?shù)牧己蒙锵嗳菪訹17-18]。根管充填后尤其是在患牙根尖部狹窄區(qū)受到炎性破壞的情況下，極佳的流動性使得iRoot?SP容易超出根尖孔與根尖周組織長期接觸，但iRoot?SP超充對患牙的愈合無明顯影響[19]，其良好的生物相容性有利于根尖周組織的健康。HiFlow與iRoot?SP的主要成分相同，僅粒度分布不同；與iRoot?SP相比在加熱時表現(xiàn)出較低的粘度，且具有更好的X線阻射性，使其更適合用于熱牙膠垂直加壓充填法，加熱溫度150～220 ℃；Brasseler USA公司稱其具有良好的生物相容性、與羥基磷灰石粘接性能、低收縮性、抗菌性、X線阻射性。由本實驗可見HiFlow對L929細胞的細胞毒性作用與MTA、 iRoot?SP類似，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義；小于AH Plus，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，認為可臨床用于根管充填。臨床廣泛應(yīng)用還需進一步的臨床應(yīng)用加以驗證。