STAT3介導(dǎo)甲狀旁腺激素調(diào)控張應(yīng)力下牙槽骨塑建

張程 呂春曉 李天成 陶貴渝 黃鸝 鄒淑娟

牙槽骨在正畸力作用下發(fā)生骨塑建，張力側(cè)表現(xiàn)為成骨，壓力側(cè)表現(xiàn)為破骨。有效的成骨塑建有助于維持正畸治療結(jié)果的穩(wěn)定，避免治療過程中牙齒的過度松動、牙槽骨吸收，是有效、穩(wěn)定、安全的正畸治療的生物學(xué)基礎(chǔ)。加強張應(yīng)力區(qū)的成骨活動，對獲得理想的正畸治療結(jié)果、減少牙周并發(fā)癥具有積極意義，尤其是成骨活動有所減弱的成年患者。

人甲狀旁腺激素(PTH)(1-34)(商品名特立帕肽)是一種通過增強成骨活動治療婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的藥物[1]，小劑量間歇性給藥通過增強成骨活動增加骨量，大劑量給藥增強破骨活動，使骨量減少[2]。有研究表明，PTH對重癥慢性牙周炎的治療有較好的效果[3]；在正畸治療方面，可以通過上調(diào)破骨細胞活性加速正畸牙移動[4-5]，有助于保持正畸治療結(jié)果的穩(wěn)定[6]，促進正畸力引起的牙根吸收的牙骨質(zhì)修復(fù)[7]。以上研究結(jié)果表明PTH可能參與了調(diào)控正畸牙槽骨塑建過程，但現(xiàn)有文獻缺乏此方面研究。深入研究PTH對正畸力作用下牙槽骨塑建的調(diào)控機制是臨床上精準(zhǔn)應(yīng)用PTH促進牙槽骨成骨塑建、降低牙槽骨吸收及復(fù)發(fā)風(fēng)險的基礎(chǔ)。

體外研究證實，PTH可以快速促進成骨細胞表達IL-6及其受體[8]。IL-6信號通路的一個重要的胞內(nèi)下游分子是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)。研究表明，STAT3的激活促進成骨前體細胞成骨向分化，骨鈣素(OCN)表達水平和堿性磷酸酶(ALP)活性提高[9]，并介導(dǎo)了IL-6家族細胞因子oncostatin M促進成骨的作用[10]。此外，STAT3是骨組織中力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，介導(dǎo)了力學(xué)加載下骨組織的形成過程[9]。但STAT3是否參與PTH調(diào)節(jié)張應(yīng)力引起的牙槽骨成骨塑建過程尚不清楚。本研究通過建立大鼠牙移動模型并應(yīng)用小鼠成骨前體細胞系MC3T3-e1，初步探究間歇性給予PTH調(diào)節(jié)正畸牙槽骨塑建中成骨活動的機制及STAT3在此過程中的作用，為臨床上改善正畸牙槽骨塑建效果提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)；青霉素-鏈霉素(雙抗)溶液、胰蛋白酶(Hyclone，美國)；人甲狀旁腺激素(1-34)(Bachem，美國)；Stattic(STAT3抑制劑)(Selleck，美國)。

1.2 實驗動物及分組

8 周齡雄性Wistar大鼠24 只(達碩實驗動物有限公司)，體重220～250 g，隨機平均分為3 組：空白組，間歇性PTH給藥組，間歇性PTH給藥加Stattic組。間歇性PTH給藥組每天相同時間在背部皮下注射40 μg/kg體重的PTH，對照組注射等體積生理鹽水。間歇性PTH給藥加Stattic組在注射PTH的同時局部注射Stattic，全身麻醉大鼠后，以微量注射器在加力的第一磨牙近中腭側(cè)距齦緣2 mm處進針，于粘骨膜下注射10 μl Stattic(50 μmol/L)，每隔1 d注射1 次，相鄰2 次注射間隔48 h；對照組注射等體積生理鹽水。從建立牙移動當(dāng)天起開始注射PTH，提前2 d開始注射Stattic。在牙移動的第14天以過量麻醉法處死大鼠，收集雙側(cè)上頜骨，4%多聚甲醛4 ℃固定48 h。

1.3 大鼠牙移動模型建立

大鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后，將鎳鈦拉簧結(jié)扎于雙側(cè)上頜第一磨牙與同側(cè)切牙之間，拉簧力值為40 g。

1.4 免疫組織化學(xué)染色及定量分析

標(biāo)本經(jīng)10%EDTA溶液脫鈣8 周后脫水、石蠟包埋、切片。切片經(jīng)常規(guī)免疫組化染色后，以Image J定量分析第一磨牙遠中頰根近牙頸部三分之一張力側(cè)牙周膜區(qū)域STAT3平均光密度及單位面積內(nèi)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(osterix,OSX)陽性細胞數(shù)。每組隨機分析3 張切片，取平均值。

1.5 細胞培養(yǎng)

小鼠成骨前體細胞MC3T3-e1(亞克隆14)，于含10%胎牛血清、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中擴增；在上述培養(yǎng)基中加入抗壞血酸(終濃度50 μg/ml)、β-甘油磷酸鈉(終濃度10 mmol/L)即為成骨誘導(dǎo)液，用于藥物刺激實驗。

1.6 間歇性PTH給藥細胞模型的建立

實驗分為空白組，間歇性PTH給藥組，間歇性PTH給藥加STAT3抑制劑Stattic組。PTH組細胞在含100 ng/ml PTH的成骨誘導(dǎo)液中孵育6 h后，換成不含PTH的成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)孵育18 h，每24 h為1循環(huán)，連續(xù)3 個循環(huán)完成間歇性PTH給藥。PTH加抑制劑組細胞在含100 ng/ml PTH和5μmol/L Stattic的成骨誘導(dǎo)液中孵育6 h后，換成僅含5 μmol/L Stattic的成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)孵育18 h，每24 h為1循環(huán)，連續(xù)進行3 個循環(huán)完成間歇性PTH與Stattic的聯(lián)合給藥。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)

用高純總RNA提取試劑盒(北京百泰克)按說明書提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度后，用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific，美國)合成cDNA，TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(Takara，日本)進行RT-qPCR檢測，檢測基因名稱及正反引物序列見表 1，以Gapdh為內(nèi)參。

表 1 RT-qPCR引物序列

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)

用總蛋白提取試劑盒(Signalway Antibody，美國)提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液于99 ℃變性。樣本于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，膜經(jīng)封閉、抗體雜交后顯影。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 間歇性PTH給藥在動物模型及細胞模型中對STAT3通路激活情況的影響

WB結(jié)果提示，PTH組MC3T3-e1細胞中STAT3總蛋白及磷酸化蛋白(Tyr705)表達量與對照組相比明顯增加(圖 1)。免疫組化結(jié)果顯示，PTH組大鼠在牙移動第14天時，張力區(qū)牙槽骨表面成骨細胞內(nèi)及牙周膜內(nèi)STAT3表達量與對照組相比明顯增加；局部注射Stattic后，STAT3表達量降低(圖 2)。

2.2 間歇性PTH全身給藥及局部注射STAT3抑制劑Stattic對大鼠正畸牙移動中成骨活動的影響

免疫組化結(jié)果顯示，PTH組大鼠在牙移動第14天張力區(qū)牙槽骨表面OSX陽性成骨細胞數(shù)量與對照組相比明顯增加，全身PTH給藥結(jié)合局部注射Stattic組OSX陽性細胞數(shù)目較PTH組明顯減少(圖 3)。

2.3 間歇性PTH給藥及STAT3抑制劑Stattic對MC3T3-e1成骨向分化的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，經(jīng)過3 個循環(huán)的間歇性PTH給藥，MC3T3-e1的成骨分化標(biāo)志基因Col1a1、Osx、Alp、Runx2表達增加；PTH與Stattic共同給藥組中，PTH對上述基因的上調(diào)作用被削弱，各基因組間表達水平均存在統(tǒng)計學(xué)差異(圖 4)。

圖 1 STAT3和p-STAT3表達在各組MC3T3-e1細胞中的表達

圖 2 大鼠牙移動張力側(cè)牙槽骨表面成骨細胞及牙周膜內(nèi)STAT3表達(免疫組化， ×100)

圖 3 大鼠牙移動張力側(cè)牙槽骨表面OSX陽性細胞數(shù)量(免疫組化， ×100)

3 討 論

近年來，尋求正畸治療的成人患者逐年增加，成人患者行正畸治療比青少年及兒童存在更高的風(fēng)險，包括：牙齦萎縮、牙齒松動、牙根吸收、治療結(jié)束后容易復(fù)發(fā)等。成人患者成骨能力下降，成骨前體細胞儲備不足，骨質(zhì)逐漸流失，是形成上述并發(fā)癥的主要原因之一[11]。因此，為了給成人患者提供安全有效的正畸治療，增強牙槽骨塑建過程的成骨活動是一個可能有效的手段。本研究發(fā)現(xiàn)，間歇性全身給予PTH可以促進大鼠正畸牙槽骨塑建中張力側(cè)牙槽骨表面細胞的成骨向分化，提高成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子OSX的表達，該分子為間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與啟動骨基質(zhì)分泌及礦化相關(guān)的諸多基因的轉(zhuǎn)錄[12]；與此同時，間歇性PTH給藥也增加該區(qū)域成骨細胞內(nèi)STAT3表達，局部注射STAT3抑制劑Stattic則削弱PTH增加成骨活動的效應(yīng)及STAT3蛋白的表達，說明STAT3參與了PTH促進成骨塑建的過程。間歇性PTH給藥可以上調(diào)小鼠成骨前體細胞系MC3T3-e1的STAT3總蛋白和磷酸化蛋白(Tyr705)水平，促進成骨分化相關(guān)基因表達，這種作用依賴于STAT3的磷酸化，可以被STAT3抑制劑Stattic削弱。本研究從體內(nèi)和體外兩方面說明，間歇性PTH給藥可以促進正畸牙槽骨成骨塑建，并通過激活STAT3發(fā)揮作用。

圖 4 MC3T3-e1細胞中成骨標(biāo)志基因Col1a1、Osx、Alp、Runx2的表達

細胞實驗結(jié)果顯示，間歇性PTH可以同時促進STAT3總蛋白和活化態(tài)蛋白即磷酸化STAT3(Tyr705)的表達。作為IL-6家族細胞因子重要的胞內(nèi)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，STAT3激活水平在間歇性PTH刺激后升高，與前期研究PTH促進成骨細胞IL-6釋放的結(jié)果相符合[8]。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)牙周膜內(nèi)IL-6和STAT3在牙移動過程中被上調(diào)[13]，說明IL-6和STAT3本身可能參與牙移動的牙槽骨塑建過程，而間歇性PTH給藥的效應(yīng)與這一生理反應(yīng)可能產(chǎn)生了協(xié)同作用。

本研究為改善正畸牙槽骨塑建、降低成人正畸治療并發(fā)癥提供了新的思路。牙周膜成纖維細胞作為正畸力轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要細胞，其在應(yīng)力微環(huán)境下對PTH的反應(yīng)值得深入研究。此外，PTH對牙槽骨塑建的破骨活動的影響也是下一步的研究方向。