利用分子標記鑒定長粒粳稻品種粒形相關基因的基因型

周雷 李二敬，2 徐華山 劉凱 李培德 游艾青，3*

（1 湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢430064；2 武漢大學研究生院，武漢430072；3 長江大學/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434025；第一作者：13971364609@163.com；*通訊作者：aq_you@163.com）

水稻是我國重要的糧食作物。我國的水稻品種屬于亞洲栽培稻，有粳稻和秈稻兩個亞種，粒長是區(qū)分秈粳兩個亞種的主要特征之一。秈稻谷粒一般較長，而粳稻谷粒相反。我國粳稻長寬比一般為1.5～2.0；長寬比大于2.5、整精米粒長≥6.5 mm 者是長粒粳稻[1]。近年來，隨著人們生活條件的改善，優(yōu)質(zhì)米受到越來越多人的追捧，對稻米的需求已由原先單一的飽腹功能轉(zhuǎn)變?yōu)榧牢?、營養(yǎng)于一體的復合型需求。受此影響，我國粳稻品種在選育過程中有長?；内厔輀2]，并出現(xiàn)了一批長粒粳稻知名品種和品牌，如東北的稻花香2 號[3]。

湖北省實施水稻“秈改粳”工程以來，粳稻發(fā)展取得了階段性成效[3]，選育了鄂粳403、鄂香2 號等一批優(yōu)質(zhì)粳稻新品種。其中，鄂香2 號長寬比達到3.2，是湖北省近年來培育并通過審定的第1 個長粒粳品種。為解析長粒粳的粒長性狀的遺傳基礎，收集了全國不同區(qū)域的7 個長粒粳品種，利用分子標記檢測方法，對10 個已克隆的水稻粒型基因進行了檢測和分析。開展本研究不僅能對現(xiàn)有長粒粳品種粒型基因型有一個全面的認識，還可為今后利用分子標記輔助培育長粒粳新品種奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及DNA 提取

供試水稻材料為7 份優(yōu)質(zhì)長粒粳材料，包括鄂香2 號、稻花香2 號、CLJ-AH（安徽省農(nóng)科院）、CLJ-YZ（揚州大學）、CLJ-HZ（中國水稻研究所）、CLJ-HB（湖北省農(nóng)科院）、CLJ-JX（浙江省嘉興市農(nóng)科院），對照為短粒粳稻品種日本晴。

所有水稻材料2018 年正季種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學院南湖水稻試驗基地，取幼嫩葉片進行基因組DNA的提取。

1.2 水稻籽粒粒形性狀相關數(shù)據(jù)測定

成熟期選取每個品種單株的主穗，考查植株粒型。將種子烘干，每個單株隨機選擇50 粒飽滿的種子用考種儀器測量各品種谷粒的粒長、粒寬、長寬比及千粒重。獲得的數(shù)據(jù)用Excel 2010 進行統(tǒng)計分析。

1.3 水稻粒形基因檢測

參考前人報道，分別合成能夠擴增GS3、LGY3/OsLG3b、qGL3、GL7/GW7、SLG7、TGW6、GS9 等 7 個粒長基因和 GS5、GW5、GW8 等 3 個粒寬基因共 10 個基因的引物序列（表1），引物均由武漢昆泰銳生物公司合成。

PCR 反應體系為 15 μL，含 1.0 μL 模板 DNA（50 ng/μL），0.2 μL Tag 酶 （5 u/μL），1.50 μL 10 ×Buffer（Mg2+plus），引物各 0.70 μL（66 ng/μL），0.8 μL dNTPs（2.5 mM/μL），補 ddH2O 至總體積為 15.00 μL。PCR 擴增程序為：95℃預變性 5 min；95℃變性 30 s，退火 30 s，延伸72℃，共35 個循環(huán)；最后72℃下延伸5 min，擴增產(chǎn)物在4℃下保存。

表1 水稻粒型相關功能分子標記

表2 7 個長粒粳品種谷粒粒形性狀測量結(jié)果

酶切體系：取 PCR 擴增產(chǎn)物 5 μL 與 PCR 管中，加入 1 μL 相應的反應緩沖液，0.3 μL 限制性內(nèi)切酶，用ddH2O 補足至 10 μL，37℃水浴 3 h，60℃停止反應。

電泳檢測：分別用PAGE 膠或瓊脂糖凝膠電泳進行目的條帶檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 7 個長粒粳品種粒形性狀

從表2 可見，7 個長粒粳品種粒長在9.28～10.80 mm 之間，粒寬在 2.69～3.11 mm 之間，長寬比在 2.98～4.02 之間，千粒重在 27.20～31.1 g 之間。t 檢驗結(jié)果表明，這7 個品種的粒長、長寬比均大于日本晴，差異極顯著（P＜0.01）；千粒重大于日本晴，差異顯著（P＜0.01）；粒寬小于日本晴，差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 基因型分析

2.2.1 GS3 基因型分析

GS3 是第1 個被克隆調(diào)控粒型的基因，是主要調(diào)控水稻粒長和粒重的主效基因，當其在第2 個外顯子上的一個C-A 突變引起N 端調(diào)控器官大小的結(jié)構(gòu)域發(fā)生功能缺失突變后，導致水稻籽粒變長。FAN 等[5]據(jù)此位點設計的引物SF28F/SF28R 對水稻材料基因組DNA 擴增，可以得到一條136 bp 的目的片段。短粒型等位基因品種的這個片段在PstI 酶切后，產(chǎn)生110 bp和26 bp 兩條片段；長粒型等位基因由于C-A 突變，產(chǎn)生的136 bp 不能被PstI 識別和酶切，還是136 bp 的片段。檢測結(jié)果顯示，只有對照品種日本晴能被PstI 識別和酶切，擴增出110 bp 片段，含有GS3 基因；長粒粳品種都不能被PstI 識別和酶切，都含有長粒的gs3 等位基因（圖 1）。

2.2.2 LGY3 基因型分析

圖1 7 個長粒粳品種GS3 基因型分析（PstI 酶切后）

圖2 7 個長粒粳品種LGY3 基因型分析

圖3 7 個長粒粳品種qGL3 基因型分析（AccI 酶切后）

圖4 7 個長粒粳品種GL7 基因型分析

LGY3/ OsLG3b 基因編碼1 個含有MADS 域的轉(zhuǎn)錄因子OsMADS1，是G 蛋白βγ 二聚體下游的關鍵效應子[6，15]。LGY3 基因在第 8 個內(nèi)含子和第 9 個外顯子之間存在1 個缺失（TCCTTGGTGAAGGTA）插入（ATGTATATATACT）突變產(chǎn)生的功能缺失，使水稻的粒長增加。根據(jù)突變位點設計引物lgy3F/lgy3R 對所選水稻材料進行擴增，如果沒有發(fā)生突變，則可以擴增出392 bp的序列，若突變成為長?；颍瑒t沒有條帶出現(xiàn)。實驗結(jié)果表明，只有稻花香2 號含有l(wèi)gy3 長粒等位基因，其它品種含有LGY3 短粒等位基因（圖2）。

2.2.3 qGL3/GL3.1/qGL3-1 基因型分析

qGL3/GL3.1/qGL3-1 是位于水稻第3 染色體上控制粒長的基因，2012 年由我國3 個實驗室同時報道，編碼1 個含有2 個Kelch 功能域的蛋白磷酸酶OsPPKL1，在水稻粒長調(diào)控中發(fā)揮負調(diào)節(jié)子的作用[7]。在此基因的第10 個外顯子處，有1 個 A/C 變異位點，與水稻的粒長相關?；蛐虯 的平均粒長超過基因型為C的平均粒長。裔傳燈等人根據(jù)這個突變位點為qGL3開發(fā)了1 個分子標記，若基因型為A，產(chǎn)生的139 bp 的目的片段缺乏AccI 識別酶切位點，不能被AccI 酶識別和酶切；基因型為C 可被AccI 酶識別和酶切，產(chǎn)生1個118 bp 的大片段和21 bp 的小基因條帶。PAGE 凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，全部品種都能被AccI 識別和酶切，判斷全都為C 基因型，屬于不含qGL3/GL3.1/qGL3-1 長?；虻钠贩N（圖3）。

2.2.4 GL7 基因型分析

GL7 是位于水稻第7 染色體上控制粒長的基因，編碼一種與擬南芥長葉蛋白同源的蛋白，調(diào)節(jié)細胞的縱向伸長，GL7 位點的1 個17.1 kb 片段的串聯(lián)復制導致GL7 的上調(diào)和附近負調(diào)節(jié)因子的下調(diào)，導致籽粒長度的增加和外觀品質(zhì)的改善。WANG 等[8]據(jù)此突變位點設計引物，若所檢測水稻材料的基因存在17.1 kb 片段的串聯(lián)重復片段，則進行PCR 時可以擴增出1 條1 421 bp 大小的片段，若沒有，則進行PCR 之后沒有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。檢測結(jié)果顯示，鄂香2 號、CLJ-YZ、CLJHZ、CLJ-HB、CLJ-JX 都能擴增出 1 421 bp 的片段，判斷其含有GL7 長?；蛐停净ㄏ? 號、CLJ-AH、日本晴沒有條帶，判斷其不含有GL7 長?；颍▓D4）。

2.2.5 SLG7 基因型分析

SLG7 是水稻第7 染色體上控制粒長的基因，縱向增加細胞長度而橫向減小細胞寬度，使籽粒細長[9]。通過比對研究發(fā)現(xiàn)，長粒等位基因啟動子-104 bp 處11 bp 的缺失與粒型緊密連鎖，據(jù)此位點開發(fā)InDel 分子標記M-SLG7-F/M-SLG7-R。利用該標記對水稻材料進行擴增，用PAGE 電泳時可以區(qū)分出11 bp 的插入-缺失，含有11 bp 的材料可以擴增出大小為109 bp 的DNA 片段，不含11 bp 的擴增出98 bp 的片段。檢測結(jié)果表明，鄂香 2 號、CLJ-YZ、CLJ-HZ、CLJ-HB、CLJ-JX擴增出98 bp 的片段，表明其含有SLG7 長?；?，稻花香2 號、CLJ-AH、日本晴擴增出109 bp 的片段，則表明它們不含SLG7 長粒等位基因（圖5）。

2.2.6 TGW6 基因型分析

圖5 7 個長粒粳品種SLG7 基因型分析

圖6 TGW6 基因型分析-BssHⅡ酶切

圖7 7 個長粒粳品種GS9 基因型分析

圖8 7 個長粒粳品種GW5 基因型分析

圖9 7 個長粒粳品種GW8 基因型分析

TGW6 是位于6 號染色體上控制水稻粒長和千粒重的基因，編碼IAA-葡萄糖水解酶，只有1 個外顯子而沒有內(nèi)含子。王軍等[10]設計了1 個CAPS-BssHII 標記，利用此標記對水稻基因組進行擴增，可以得到1 個590 bp 的目的片段，長粒等位基因型可被BssHII 識別和酶切，產(chǎn)生1 個372 bp 和217 bp 2 個條帶；短粒等位基因PCR 產(chǎn)物不能被BssHII 限制內(nèi)切酶識別和酶切，還是590 bp 條帶。結(jié)果所示，陽性對照II-32B 有2個帶條，7 個長粒粳品種和日本晴不能被BssHII 識別和酶切只有1 個條帶，判斷其不含TGW6 長粒等位基因（圖6）。

2.2.7 GS9 基因型分析

GS9 是水稻9 號染色體上控制粒長的基因，編碼一種沒有已知保守功能域的蛋白質(zhì)，是調(diào)控水稻粒型和外觀品質(zhì)的轉(zhuǎn)錄激活因子。ZHAO 等[11]根據(jù)多態(tài)性位點第2 外顯子7 kb 的插入開發(fā)了InDel 分子標記。GS9短粒等位基因型材料無7 kb 片段的插入，PCR 可得到250 bp 左右的片段；gs9 長粒等位基因材料有7 kb 插入片段，不會產(chǎn)生250 bp 左右的片段。對產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，檢測結(jié)果表明產(chǎn)物都在250 bp 左右，說明7個長粒粳品種和日本晴都不含有7 kb 插入，判斷其都不含有GS9 長?；颍▓D7）。

2.2.8 GW5/qSW5 基因型分析

GW5 是位于5 號染色體上控制水稻粒寬的基因，窄粒水稻與寬粒水稻相比，發(fā)現(xiàn)寬粒品種核苷酸有段1 212 bp 的缺失。王鳴森[12]根據(jù)這個1 212 bp 差異的缺失設計了1 個InDel 標記。用該引物對檢測水稻材料擴增，寬粒等位基因品種PCR 之后沒有PCR 產(chǎn)物；窄粒等位基因擴增產(chǎn)物為775 bp 的片段。瓊脂糖電泳檢測結(jié)果表明，只有CLJ-HZ 含有1 212 bp 核苷酸的缺失，說明CLJ-HZ 含有GW5 寬?；?。其它長粒粳品種和日本晴都不存在1 212 bp 核苷酸的缺失，說明都不含GW5 寬粒基因（圖8）。

2.2.9 GW8 基因型分析

GW8 是位于8 號染色體上控制水稻粒寬的基因，裔傳燈等[13]根據(jù)該基因啟動子區(qū)10 bp 的InDel 和第3外顯子A/C 和T/G 的2 個錯義位點分別開發(fā)了功能標記（GW8-1）、dCAPs（GW8-2）和 CAPs（GW8-3），并依據(jù)這3 個變異位點將該基因分成8 種單倍型，Hap1、Hap2、Hap3、Hap7 的粒長相對于 Hap4、Hap5、Hap6 的較長。對于GW8-1 引物，若所檢測水稻材料存在10 bp序列插入片段，則進行PCR 之后會產(chǎn)生151 bp 的片段，若不存在10 bp 序列插入片段則會產(chǎn)生141 bp 的片段。檢測結(jié)果表明，鄂香2 號的3 個檢測位點分別屬于10 bp+、A、T 三種等位基因，屬于粒寬的Hap3 單倍型；稻花香 2 號、CLJ-AH、CLJ-YZ、CLJ-HZ、CLJ-HB、CLJ-JX、日本晴的3 個檢測位點分別屬于10bp-、C、G三種等位基因，屬于粒寬變小的Hap6 單倍型（圖8）。

2.2.10 GS5 基因型分析

GS5 位于水稻5 號染色體上，是一個控制水稻粒寬、充實度和千粒重的數(shù)量性狀基因，編碼1 個絲氨酸羧肽酶；GS5 在第2 外顯子的ACC/CTA 和第9 外顯子A/C 的2 個變異位點對水稻籽粒的粒長、粒寬和長寬比性狀存在顯著差異。裔傳燈等[14]根據(jù)這2 個位點分別設計2 個CAPS 標記GS5-1 和 GS5-2，依據(jù)這 2 個變異位點將該基因分成4 種單倍型，GS5-1 可以擴增出225 bp 的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)過DdeI 酶切后，能夠被切成196 bp 的片段，基因型為CTA，不能被切的基因型為ACC，GS5-2 可以擴增出 188 bp 的 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)過 SalI酶切后，能夠被切成169 bp 的片段，基因型為C，不能被切的基因型為A。以長粒的珍汕97B 作對照，結(jié)果顯示，7 個長粒粳均出現(xiàn)225 bp 和188 bp 條帶，對應變異位點為ACC 和A，和日本晴單倍型一致（圖10）。

表3 7 個長粒粳品種粒型基因檢測結(jié)果

圖10 7 個長粒粳品種GS5 基因型分析

2.2.11 7 個長粒粳品種10 個粒形相關基因的基因型綜合分析

檢測結(jié)果表明，7 個長粒粳稻都含有gs3 長?；颍欢跸?2 號、CLJ-YZ、CLJ-HZ、CLJ-HB、CLJ-JX 等 5個品種帶有GL7、SLG7 長粒等位基因；稻花香2 號帶有l(wèi)gy3 長粒等位基因；鄂香2 號帶有GW8 寬粒等位基因；CLJ-HZ 帶有GW5 粒寬等位基因；被測水稻中均不含 qGL3、TGW6、gs9 長粒等位基因和 GS5 粒寬等位基因。

3 討論

水稻的粒形性狀與產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關，主要包括粒長、粒寬、粒厚、長寬比和長厚比等；粒長不僅決定稻米的外觀品質(zhì)和碾磨品質(zhì)，而且對水稻的千粒重也有影響[1]。盡管粒長是數(shù)量性狀，與環(huán)境條件有一定關系，但基因型仍是決定粒長的關鍵因素。一般來講，粳稻的蒸煮食味品質(zhì)要優(yōu)于秈稻，而在粒型上，秈稻比粳稻要長，外觀品質(zhì)更佳，市場競爭力強。長粒大米受到消費者的喜愛，育種家們根據(jù)經(jīng)驗在田間選育出了長粒粳稻品種，但是其中的遺傳和分子機制還不清楚。未來的粳稻育種需要著重改良粒型，利用已經(jīng)克隆的粒長相關基因，開展分子輔助育種，并應用于育種實踐，有助于水稻單產(chǎn)的提高和稻米品質(zhì)的改良。

到目前為止，水稻中共定位到100 多個與粒長相關的QTLs，大多數(shù)定位結(jié)果顯示，控制粒長的主效QTLs 位于第3 染色體和第7 染色體[16]。對位于第3 染色體上的粒長主效基因，一般認為是GS3 和qGL3 基因。但丁丹等[17]研究認為，在這2 個基因都存在時，并未表現(xiàn)出基因累加效應，而只有其中1 個基因存在時，才表現(xiàn)出較強的表型效應。由于qGL3 基因分布較少，所以第3 染色體上控制粒長的基因主要是GS3，因此，更多研究也集中在GS3 基因上。張磊[18]利用秋B 攜帶的GS3 基因?qū)Σ〣 的粒長進行了改良，獲得了長谷粒型的博B。張劍霞等[19]用MAS 技術將GS3 導入到珍汕97B 和II-32B 中，使珍汕97B 的粒長由原來的8.0 mm增加到9.8 mm，II-32B 粒長由原來8.0 mm 增加到9.7 mm，粒長改良效果明顯。楊梯豐[20]利用攜帶GS3 基因的單片段代換系進行長粒稻育種，有效改良了華粳秈74 的外觀品質(zhì)。WANG 等[21]分別將 9311 的 GS3 導入到珍汕97B 中，不僅使珍汕97B 的粒長增加了0.9 mm，達到9.2 mm，千粒重也有所增加，改良后的珍汕97B 不僅外觀品質(zhì)更好，產(chǎn)量也有所提高。這些gs3 基因在秈稻粒形改良上的應用為粳稻粒形改良提供了借鑒。

在長粒粳稻研究中，孟帥等[22]利用CRISPR/Cas9技術敲除GS3 基因，增加了11 個粳稻品種的粒長，進而改善了花時，為雜交粳稻育種提供了一個新的思路。LIU 等[6]發(fā)現(xiàn)，lgy3 和gs3 等位基因的聚合提高了總籽粒產(chǎn)量（約7%），且改善了稻米品質(zhì)，為同時選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻提供了一種新的策略。從本研究可以看出，gs3 基因在長粒粳稻傳統(tǒng)經(jīng)驗育種中已得到了廣泛應用，7 個長粒粳稻品種都含有gs3 基因，分析原因除了gs3 基因是主效基因外，還在于它的親本中分布較廣，熱帶粳稻和長粒秈稻均含有gs3 基因。本研究發(fā)現(xiàn)，7個優(yōu)質(zhì)長粒粳稻品種中有5 個含有GL7 和SLG7 基因，說明這2 個基因在長粒粳稻育種中有較好的應用前景。7 個長粒粳稻品種中未發(fā)現(xiàn)qGL3、TGW6、gs9 的長粒等位基因，可能與這些基因在水稻資源中分布頻率較低有關，利用分子標記技術進行定向選擇，有利于這些基因在育種中的利用。