鹵代羥基烷類吸入用麻醉劑對(duì)血液中乙醇含量檢測(cè)的影響

謝冰，閆文靜，孟憲躍，苗鑫剛，于峰，董玫，施妍，向平，馬春玲，文迪

（1.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院 河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心，河北 石家莊050017；2.河北黃驊法醫(yī)鑒定中心，河北 黃驊 061100；3.石家莊市公安局交通管理局，河北 石家莊050091；4.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

采用頂空氣相色譜法進(jìn)行血液中乙醇含量檢測(cè)時(shí)，與乙醇或內(nèi)標(biāo)具有相似色譜行為的化合物可對(duì)檢測(cè)形成干擾，尤其是采用氣相色譜單柱單檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無法對(duì)假陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行有效甄別[1]。以往研究[2]發(fā)現(xiàn)，鹵代羥基烷類吸入用全身麻醉劑與醇類的色譜行為相似。同時(shí)，由于在交通事故中，肇事者或受害者血液樣本經(jīng)常在醫(yī)療搶救或全麻手術(shù)過程中（后）提取，從而導(dǎo)致酒駕或醉駕的誤判。本研究采用頂空氣相色譜雙柱雙檢測(cè)器確認(rèn)法分析鹵代羥基烷類吸入用全身麻醉劑地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷，觀察4種麻醉劑對(duì)頂空氣相色譜法檢測(cè)血液中乙醇含量的影響，并比較J&W DB-ALC1/DB-ALC2和KBBAC1/KB-BAC2雙柱系統(tǒng)的檢測(cè)效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷對(duì)照品（純度均大于99.0%）均購(gòu)自北京百靈威科技有限公司，乙醇對(duì)照品（含量不小于99.5%）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，叔丁醇購(gòu)自北京DiKMA公司，實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水。

1.2 主要儀器

7890A氣相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），7694E頂空進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）。J&W DB-ALC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，1.8 μm，美國(guó)Agilent公司），J&W DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱（30m×0.32 mm，1.2 μm，美國(guó)Agilent公司），KB-BAC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，1.8 μm，北京科瑞邁科技有限責(zé)任公司），KB-BAC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，1.2 μm，北京科瑞邁科技有限責(zé)任公司）。

1.3 溶液配制

麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷對(duì)照品0.1 g溶于10 mL二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）中，然后取 10 μL添加至50mL超純水中，充分渦旋振蕩混勻后超聲10min。

乙醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取1.005 g乙醇對(duì)照品置于100 mL容量瓶中，添加純水至100 mL，混勻，得1 g/100 mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。試驗(yàn)中所需濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液可從上述乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋而得。

叔丁醇內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取4.02 g叔丁醇對(duì)照品置于100 mL容量瓶中，添加純水至100 mL，混勻，得4 g/100 mL叔丁醇內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。使用時(shí)，準(zhǔn)確量取1mL叔丁醇內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液置于1000mL容量瓶中，添加純水至1 000 mL，混勻，獲得4 mg/100 mL叔丁醇標(biāo)準(zhǔn)使用液，分裝后置4℃冰箱中保存。

1.4 樣品前處理

取0.5mL的叔丁醇標(biāo)準(zhǔn)使用液加入頂空瓶?jī)?nèi)，再加入0.1 mL待測(cè)樣品，封口鉗將其迅速密封，混勻后置于頂空進(jìn)樣器內(nèi)加熱待檢。

1.5 頂空氣相色譜分析條件

參照《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗(yàn)方法》（GA/T 1073—2013）[3]（以下簡(jiǎn)稱《方法》）中的儀器分析條件，采用頂空氣相色譜法對(duì)血液中常見鹵代羥基烷類吸入用全身麻醉劑地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷進(jìn)行檢測(cè)。頂空進(jìn)樣器加熱箱爐溫65℃，定量環(huán)溫度105℃，傳輸線溫度110℃，樣品瓶加熱平衡時(shí)間10 min。檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）（美國(guó) Agilent公司），柱溫40℃，檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣口溫度150℃，載氣流速8mL/min，燃?xì)猓錃猓?0mL/min，空氣400mL/min，尾吹（氮?dú)猓?5mL/min。

1.6 不同色譜條件對(duì)分離效果的影響

使用J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱，固定載氣流速為8 mL/min，在柱箱溫度分別為40℃、50℃和60℃的條件下，觀察其對(duì)七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇的分離效果。此外，固定柱箱溫度為50℃，在載氣流速分別為6、4和2mL/min的條件下，觀察其對(duì)七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇的分離效果。

1.7 不同色譜柱體系抗干擾能力的比較

使用KB-BAC1/KB-BAC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱檢測(cè)4種鹵代羥基烷類吸入性全身麻醉劑，并檢測(cè)在該色譜條件下4種鹵代羥基烷類吸入性全身麻醉劑對(duì)血液中乙醇含量檢測(cè)的影響。

2 結(jié) 果

2.1 地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷的檢測(cè)（頂空氣相色譜雙柱確認(rèn)法）

參照《方法》[3]中的儀器分析條件，首先使用7890A氣相色譜儀、7694E頂空進(jìn)樣器和J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱對(duì)地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷進(jìn)行分析。如圖1所示，上述4種鹵代吸入性全身麻醉劑均具有較好的響應(yīng)，色譜峰型良好，在J&W DB-ALC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱中的保留時(shí)間分別為0.909、1.232、1.373、1.533 min；在J&W DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱中的保留時(shí)間分別為0.891、1.184、1.426、1.548min。

圖1 地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷應(yīng)用J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱分析的色譜峰Fig.1 Chromatographic peaks of desflurane，sevoflurane，isoflurane and enflurane analyzed by J&W DB-ALC1/DB-ALC2 quartz capillary gas chromatographic column

2.2 地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷對(duì)血液中乙醇含量檢測(cè)的影響

依據(jù)《方法》[3]中的儀器分析條件，使用7890A氣相色譜儀、7694E頂空進(jìn)樣器和J&W DB-ALC1/DBALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱進(jìn)行血液中乙醇含量分析。如圖2所示，乙醇和內(nèi)標(biāo)叔丁醇在J&W DB-ALC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱的保留時(shí)間分別為1.118、1.607min，在J&W DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱的保留時(shí)間分別為1.211、1.614min。將地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷與乙醇和叔丁醇混合后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在J&W DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱系統(tǒng)中，七氟烷與乙醇的保留時(shí)間基本一致，無法分離和定性甄別，恩氟烷的保留時(shí)間與叔丁醇相近，影響了乙醇的定量分析；在J&W DB-ALC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱系統(tǒng)中，七氟烷與乙醇可以有效分離，但恩氟烷的保留時(shí)間仍與叔丁醇接近。

2.3 不同色譜條件對(duì)七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇的分離效果

使用J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱，通過改變柱箱溫度、載氣流速參數(shù)，以觀察其對(duì)七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，升高柱溫后，可一定程度地分離J&W DB-ALC2色譜柱中的七氟烷和乙醇，但在40℃～60℃范圍內(nèi)仍無法完全分離。而在柱溫50℃條件下，在2～8mL/min范圍內(nèi)改變載氣流速，降低載氣流速，可一定程度地分離七氟烷、恩氟烷、乙醇和叔丁醇成分的色譜峰，但是目標(biāo)物的響應(yīng)值顯著降低，從而降低乙醇的檢出限。

2.4 不同色譜柱體系抗干擾能力的比較

此外，本研究還考察了KB-BAC1/KB-BAC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱對(duì)4種鹵代羥基烷類吸入性全身麻醉劑的檢測(cè)能力以及在該色譜條件下4種鹵代羥基烷類吸入性全身麻醉劑對(duì)血液中乙醇含量檢測(cè)的影響。上述4種鹵代羥基烷類吸入性全身麻醉劑均具有較好的響應(yīng)，色譜峰型良好，在KB-BAC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱中的保留時(shí)間分別為1.012、1.544、1.943、2.098 min，在 KB-BAC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱中的保留時(shí)間分別為0.766、0.903、0.979、1.065 min。使用該色譜柱進(jìn)行血液中乙醇含量檢測(cè)時(shí)，乙醇和內(nèi)標(biāo)叔丁醇在KB-BAC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱中的保留時(shí)間分別為1.566、2.341 min，在KBBAC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱中的保留時(shí)間分別為0.933、1.179 min。將地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷與乙醇和叔丁醇混合后進(jìn)行檢測(cè)，在KB-BAC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱系統(tǒng)中，七氟烷與乙醇的保留時(shí)間相近，色譜峰重合，無法進(jìn)行定性甄別；在KBBAC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱系統(tǒng)中，七氟烷、異氟烷與乙醇的保留時(shí)間均相近，尤其是七氟烷與乙醇的色譜峰基本重合。

圖2 乙醇、叔丁醇及4種麻醉劑混標(biāo)在J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱中的色譜峰Fig.2 Chromatographic peaks of ethanol，tert butyl alcohol and four anesthetics analyzed by J&W DB-ALC1/DB-ALC2 quartz capillary gas chromatographic column

2.5 案例應(yīng)用

2.5.1 案例1

某女性，某日10：00左右與對(duì)向行駛的機(jī)動(dòng)車發(fā)生交通事故。要求對(duì)事故雙方血液中乙醇含量進(jìn)行檢測(cè)。參照《方法》[3]中的儀器分析條件，首先使用7890A氣相色譜儀、7694E頂空進(jìn)樣器和J&W DBALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱對(duì)血液中乙醇含量進(jìn)行檢測(cè)。機(jī)動(dòng)車駕駛員血液中未檢出乙醇成分。

對(duì)該女性血液進(jìn)行檢測(cè)，通過J&W DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱結(jié)果（圖3）推測(cè)乙醇質(zhì)量濃度為41.46mg/100mL，而J&W DB-ALC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱結(jié)果顯示，未檢出乙醇成分。經(jīng)案情調(diào)查，該女性的血液樣本是在手術(shù)搶救過程中提取，且J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱中的色譜峰保留時(shí)間均與七氟烷一致，故可考慮J&W DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱為七氟烷的干擾。因此，本案中該女性的鑒定意見為“未檢出乙醇成分”。

2.5.2 案例2

李某，男，某日22：00左右駕駛機(jī)動(dòng)車發(fā)生交通事故。要求對(duì)李某血液中乙醇含量進(jìn)行檢測(cè)。參照《方法》[3]中的儀器分析條件，首先使用7890A氣相色譜儀、7694E頂空進(jìn)樣器和J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱對(duì)血液中乙醇質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)。通過J&W DB-ALC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱結(jié)果（圖4）推測(cè)乙醇質(zhì)量濃度為201.43mg/100mL，而通過J&W DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱結(jié)果推測(cè)乙醇質(zhì)量濃度為247.95mg/100mL。通過查閱色譜圖，發(fā)現(xiàn)J&W DB-ALC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱系統(tǒng)中分別存在乙醇和七氟烷特征色譜峰，而J&W DBALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱系統(tǒng)中乙醇和七氟烷的色譜峰重合。通過案情調(diào)查，李某的血液樣本是在手術(shù)搶救過程中提取，查閱手術(shù)記錄發(fā)現(xiàn)確有使用七氟烷進(jìn)行麻醉。故J&W DB-ALC1/DB-ALC2石英毛細(xì)管氣相色譜柱所得結(jié)果不一致的原因?yàn)槠叻榈母蓴_。本案應(yīng)采用J&W DB-ALC1石英毛細(xì)管氣相色譜柱系統(tǒng)的定量結(jié)果。

圖3 案例1氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatography of case 1

圖4 案例2氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatography of case 2

3 討論

自醉酒駕駛機(jī)動(dòng)車于2011年納入刑事犯罪以來，機(jī)動(dòng)車駕駛?cè)藛T血液中乙醇含量是對(duì)該類案件定罪量刑的關(guān)鍵證據(jù)。頂空氣相色譜法是目前血液中乙醇含量檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[3]中規(guī)定使用的方法。但是，僅通過單柱的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析存在較大風(fēng)險(xiǎn)，雙柱雙檢測(cè)器確認(rèn)的方法從一定程度上降低了該方法進(jìn)行定性分析的風(fēng)險(xiǎn)[4]。本研究觀察了4種鹵代羥基烷類吸入用全身麻醉劑對(duì)血液中乙醇含量檢測(cè)的影響，并基于兩套不同的色譜柱考察了雙柱雙檢測(cè)器檢測(cè)方法的抗干擾能力。結(jié)果顯示，七氟烷與乙醇的保留時(shí)間相近，對(duì)乙醇的定性分析存在較大影響，通過J&W DB-ALC1/DB-ALC2雙柱雙FID檢測(cè)器系統(tǒng)可予以甄別，改變柱溫和載氣流速也可一定程度地排除干擾物的影響。恩氟烷對(duì)血液中乙醇的定性分析雖無明顯影響，但在采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行乙醇定量分析時(shí)，還需通過改變色譜條件，提高分離度以排除恩氟烷的干擾。而KB-BAC1/KB-BAC2雙柱雙FID檢測(cè)器系統(tǒng)對(duì)七氟烷和乙醇均無法進(jìn)行有效分離以排除干擾，其他3種鹵代羥基烷類吸入性全身麻醉劑對(duì)血液中乙醇含量無明顯影響，或可通過雙柱系統(tǒng)予以解決。吸入用麻醉藥物是以氣體形式通過呼吸道進(jìn)入人體內(nèi)發(fā)揮麻醉作用。雖然靜脈麻醉藥物丙泊酚在臨床已得到廣泛使用，但由于吸入麻醉藥物具有麻醉效能強(qiáng)、可控性高的特點(diǎn)，其在全身麻醉中特別是在成人和兒童全身麻醉的誘導(dǎo)和維持過程中依然占據(jù)主導(dǎo)地位[5-6]。目前，鹵代羥基烷類揮發(fā)性吸入用麻醉藥物是目前臨床較為常用的吸入用麻醉藥物，包括甲氧氟烷、恩氟烷、異氟烷、七氟烷和地氟烷[7]。在本研究提及的2個(gè)乙醇含量檢測(cè)案例中，被鑒定人血液中均檢出七氟烷成分，其原因均為手術(shù)搶救過程使用了揮發(fā)性吸入用麻醉藥物七氟烷，且血液樣品是在手術(shù)過程中采集。通過雙柱雙FID檢測(cè)器系統(tǒng)有效地排除了七氟烷的干擾，得到了正確的鑒定意見。值得注意的是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙柱雙FID檢測(cè)器系統(tǒng)中所使用的氣相色譜柱是該方法的關(guān)鍵因素，即使使用了雙柱雙FID檢測(cè)器系統(tǒng)，但如不同氣相色譜柱的區(qū)分效能不足，則仍然能導(dǎo)致誤判的發(fā)生。因此，進(jìn)行深入的案情調(diào)查，選擇不同的色譜條件確證或采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定性分析是得到正確鑒定意見的有效方法。目前，在多數(shù)的基層鑒定機(jī)構(gòu)中，多使用單柱單FID檢測(cè)器進(jìn)行駕駛?cè)藛T血液中乙醇含量檢測(cè)。工作中，由于對(duì)案情缺乏細(xì)致深入的調(diào)查，且分析經(jīng)驗(yàn)不足，則可能因鹵代吸入用全身麻醉劑引起的假陽(yáng)性結(jié)果導(dǎo)致酒駕或醉駕的誤判。此外，以往研究[1]還發(fā)現(xiàn)丙酮也可能因?yàn)榕c內(nèi)標(biāo)叔丁醇的保留時(shí)間一致，從而導(dǎo)致定量結(jié)果產(chǎn)生較大誤差。因此，筆者認(rèn)為：（1）使用雙柱雙FID檢測(cè)器系統(tǒng)進(jìn)行血液中乙醇含量檢測(cè)是降低誤判發(fā)生率的有效方法；（2）交通肇事或乙醇中毒類案件中，血液樣品采集過程應(yīng)予以詳細(xì)記錄，并在實(shí)施搶救過程前完成樣品采集；（3）不同色譜柱產(chǎn)品的分離效能存在諸多差異，實(shí)際工作過程中還應(yīng)結(jié)合案情對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道中易產(chǎn)生假陽(yáng)性的化合物進(jìn)行考察，必要時(shí)應(yīng)優(yōu)化色譜條件或通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定性分析。

綜上，本研究探討了鹵代吸入用全身麻醉劑地氟烷、七氟烷、異氟烷和恩氟烷對(duì)頂空氣相色譜法檢測(cè)血液中乙醇含量的影響，七氟烷和恩氟烷成分易對(duì)乙醇和叔丁醇的色譜行為造成干擾，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱進(jìn)行雙柱確認(rèn)檢測(cè)可有效予以甄別。該結(jié)果對(duì)交通肇事類案件血液樣本采集過程和血液中乙醇含量檢測(cè)方法的規(guī)范化具有重要意義。