手術(shù)聯(lián)合細(xì)胞治療皮膚型黑色素瘤的療效觀察

張啟婷，趙 華，李文明，曹曉卉，賈紹昌

黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一種因黑色素細(xì)胞病理性增生導(dǎo)致的惡性腫瘤，早期便可發(fā)生轉(zhuǎn)移，具有惡性程度高，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，死亡率高等特點(diǎn)[1]。局部增生或原位癌等早期MM患者，通過(guò)手術(shù)治療可得到痊愈，但許多患者早期未予重視，常發(fā)展到中晚期，特別是發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，則很難治愈，術(shù)后復(fù)發(fā)率極高。其中位生存期僅8～9月，三年生存率僅10%～15%，5年生存率少于10%[2]。MM常規(guī)治療方案首選手術(shù)治療，輔助放化療，但MM對(duì)放化療敏感性極低[3]。近年來(lái)隨著人類對(duì)腫瘤免疫認(rèn)識(shí)的提高，腫瘤的免疫治療有了迅速的發(fā)展，同時(shí)免疫治療也成為腫瘤治療領(lǐng)域的熱門(mén)領(lǐng)域，成為人類攻克惡性腫瘤的新希望。MM為目前研究的對(duì)免疫治療敏感性較強(qiáng)的一種，因而成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者在免疫治療方面的主要研究對(duì)象[4]。課題組之前針對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cytokine-induced killer，CIK)細(xì)胞對(duì)MM患者的免疫療效已有報(bào)道[5]。該研究收集手術(shù)治療聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞療法的患者及單獨(dú)使用手術(shù)治療的患者，回顧性分析兩者產(chǎn)生臨床收益的差別。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取于2008年6月～2018年6月在中國(guó)人民解放軍第八一醫(yī)院住院治療的59例皮膚型MM患者?；颊吣挲g24～88歲，中位年齡60歲，其中32例接受手術(shù)聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞治療，27例接受手術(shù)治療。兩組患者病例資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：① 經(jīng)病理學(xué)確診為黑色素細(xì)胞瘤，并且原發(fā)灶位于皮膚；② 治療組患者經(jīng)過(guò)至少2次及以上的DC-CIK細(xì)胞治療，并且未接受其他輔助治療；③ 對(duì)照組患者經(jīng)過(guò)手術(shù)治療僅輔以姑息治療；④ 卡氏(karnofsky，KPS)功能狀態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分≥60分，預(yù)計(jì)生存期不少于3個(gè)月；⑤ 心、肝、腎等主要臟器無(wú)明顯功能異常。治療組病例排除標(biāo)準(zhǔn)：① 懷孕或哺乳期女性；② 年齡≤18周歲；③ 有嚴(yán)重感染性疾病、自身免疫病或器官衰竭者；④ 對(duì)生物制劑過(guò)敏者?；颊卟煌∏?、性別及年齡比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，比較具有合理性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核同意，由患者或其家屬知情并簽署同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1主要儀器與試劑 COM.TE血細(xì)胞分離機(jī)購(gòu)自德國(guó)Fresenius公司；Beckman Coulter XL流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman 公司；eppendorf Centrifuge 5810 R離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)eppendorf公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；抗CD3單克隆抗體購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；KBM-581、KBM-551培養(yǎng)基、臨床使用標(biāo)準(zhǔn)品rhG-CSF均購(gòu)自康寧生命科學(xué)有限公司；臨床使用標(biāo)準(zhǔn)品重組人白介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)購(gòu)自北京四環(huán)生物制藥有限公司；重組人干擾素(recombinant human interferon，rhIFN-γ)購(gòu)自上海生物醫(yī)藥有限公司；重組人白介素-4(recombinant human interleukin-4，rhIL-4)、重組人腫瘤壞死因子(recombinant human tumor necrosis factor-α，rhTNF-α)均購(gòu)自美國(guó)Peprotech 公司；流式抗體CD3-ECD、CD4-PC5、CD8-FITC、CD86-PC5、CD11c-PE、HLA-DR-ECD、CD83-FITC、CD80-FITC、CD54-PC5、CD4-FITC、CD3-PC5、CD8-PE、CD25-PE、CD16+CD56-PE均購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。

表1 兩組患者臨床資料比較(n=59)

1.2.2治療 按照《中國(guó)黑色素瘤診療指南》[3]，手術(shù)視原發(fā)灶部位選擇麻醉方式，沿原發(fā)病灶邊緣1～3 cm范圍完整切除病灶，切除深度至深筋膜深面，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者做區(qū)域淋巴結(jié)清掃，伴轉(zhuǎn)移灶者可做轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)。術(shù)后對(duì)照組輔以對(duì)癥姑息治療，治療組予以DC-CIK細(xì)胞治療，DC疫苗于第7天開(kāi)始每隔一周分4次于皮下六點(diǎn)注射(雙側(cè)鎖骨下、雙側(cè)腋窩下、雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)引流區(qū))，回輸量約1.0×107～4×107/次，CIK細(xì)胞于9～21 d內(nèi)視情況分3次輸完，回輸量約1.0×109～3×109/次。每個(gè)療程間隔3個(gè)月。

1.2.3DC-CIK細(xì)胞及DC疫苗的制備 運(yùn)用血細(xì)胞分離機(jī)采取患者自體血60 ml，置于50 ml離心管，離心分離出血漿，56 ℃水浴滅活用于后期細(xì)胞培養(yǎng)。血細(xì)胞用生理鹽水稀釋，加入淋巴細(xì)胞分離液，密度梯度離心，吸取白膜層即外周血單個(gè)核細(xì)胞層，用KBM-551培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為(2×106～3×106) /ml,鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，孵育1～2 h，移出上層培養(yǎng)液留于CIK細(xì)胞的培養(yǎng)。向培養(yǎng)瓶中加入含rhIL-4 10 ng/ml和重組人粒細(xì)胞刺激因子注射液(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)500 U/ml的KBM-581培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，第5天加入抗原致敏，第6天加入rhTNF-α 500 U/ml,第7天回收DC細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，回輸前進(jìn)行細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素檢測(cè)，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞表型(HLA-DR+、CD11c+、CD54+、CD80+、CD83+、CD86+)。CIK細(xì)胞的制備：將之前收集的懸浮細(xì)胞用KBM-551培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106/ml，添加rhIFN-γ 1 000 U/ml，24 h后rhIL-2 500 U/ml、antiCD3 mAb 50 ng/ml，隔天補(bǔ)液，并添加400 U/ml rhIL-2,視細(xì)胞狀態(tài)及數(shù)量于細(xì)胞培養(yǎng)第9～21天內(nèi)將細(xì)胞分3次回收輸入患者體內(nèi)，回輸前進(jìn)行細(xì)菌、真菌、內(nèi)毒素檢測(cè)，流式檢測(cè)CIK細(xì)胞表型(CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+，主要為CD3+CD56+)。

1.3 評(píng)價(jià)方法

1.3.1隨訪 對(duì)每位患者進(jìn)行隨訪，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為89個(gè)月。從治療開(kāi)始到死亡或至隨訪截至日期計(jì)算總生存期(overall survival,OS)，從治療開(kāi)始至疾病進(jìn)展計(jì)算無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)。

1.3.2免疫功能 分別于治療前及治療后兩個(gè)月內(nèi)抽取患者外周血，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的分布情況，主要指標(biāo)為CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD4+CD25+。

1.3.3療效觀察 ① 治療期間密切觀察患者癥狀、體征，注意是否發(fā)生不良反應(yīng)，并記錄其表現(xiàn)、發(fā)生時(shí)間、處理方法及轉(zhuǎn)歸(不良反應(yīng)評(píng)級(jí)按照美國(guó)國(guó)立癌癥研究所《常見(jiàn)不良反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行評(píng)估。② 治療后1個(gè)月復(fù)查血常規(guī)、肝功能，3個(gè)月復(fù)查胸腹部X線計(jì)算機(jī)斷層攝影(computed tomography, CT)，了解有無(wú)復(fù)發(fā)，病情穩(wěn)定可延長(zhǎng)至3～6個(gè)月復(fù)查。③ 密切觀察患者治療前后精神狀態(tài)、睡眠及進(jìn)食情況；觀察治療前后生活質(zhì)量變化，采用KPS功能狀態(tài)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以治療后KPS增加≥10分為生活質(zhì)量改善，變化<10分為生活質(zhì)量穩(wěn)定，減少≥10分為生活質(zhì)量降低，以生活質(zhì)量改善為有效，穩(wěn)定及降低為無(wú)效。

2 結(jié)果

2.1 DC-CIK細(xì)胞鑒定DC細(xì)胞培養(yǎng)后伸出突觸，并隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，觸角增多增長(zhǎng)，第7天流式檢測(cè)成熟DC細(xì)胞表面標(biāo)志，HLA-DR、CD54、CD80、CD83、CD86大于90%；CIK細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞變大，聚集成團(tuán)，第10天流式檢測(cè)CIK細(xì)胞，效應(yīng)型細(xì)胞CD3+CD8+、CD3+CD56+數(shù)量明顯增多。見(jiàn)圖1。

圖1 DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)前后變化 ×400

A：DC細(xì)胞培養(yǎng)前后照片；B：CIK細(xì)胞培養(yǎng)前后照片；1：培養(yǎng)前；2：培養(yǎng)后

2.2 兩組OS及PFS比較治療組32例，死亡15例，中位OS為49個(gè)月，中位PFS為19.5個(gè)月，1年生存率84.4%，3年生存率62.5%，5年生存率37.5%；對(duì)照組27例，死亡17例，中位OS為27個(gè)月，中位PFS為13個(gè)月；1年生存率77.8%，3年生存率29.6%，5年生存率14.8%；χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組生存率優(yōu)于對(duì)照組，其中3年生存率差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.012)，見(jiàn)表2；Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank test檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組患者OS比較，治療組患者OS優(yōu)于對(duì)照組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028 7)，兩組患者PFS比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.165 0)。見(jiàn)圖2。

表2 兩組患者生存率比較[n(%)]

2.3 兩組患者治療前后免疫功能變化比較對(duì)兩組患者治療前后進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，結(jié)果顯示：對(duì)照組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD3-CD56+細(xì)胞亞群比例無(wú)明顯變化(P>0.05)；治療組總T淋巴細(xì)胞比例較治療前增高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.0316)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞較治療前明顯上升(P=0.0088)，抑制性T淋巴細(xì)胞較治療前下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0040)，余無(wú)明顯變化。見(jiàn)表3。舉1例治療組患者淋巴細(xì)胞亞群為例，可見(jiàn)CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD56+增高，CD4+CD25+、CD3+CD8+明顯降低。見(jiàn)圖3。

圖2 兩組患者OS及PFS曲線

A：兩組患者OS曲線比較；B：兩組患者PFS曲線比較

表3 兩組患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化情況比較

圖3 治療組1例患者治療前后的淋巴細(xì)胞亞群圖

A：細(xì)胞治療前；B：細(xì)胞治療后；1：CD3+流式圖；2：CD3+CD4+流式圖；3：CD3+CD8+流式圖；4：CD4+CD25+流式圖；5：CD3-CD56+流式圖

2.4 兩組患者治療前后生活質(zhì)量改變比較治療組中有效22例，無(wú)效10例；對(duì)照組中有效11例，無(wú)效16例，Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)顯示治療組的生活質(zhì)量改善情況優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P=0.025)。見(jiàn)表4。

表4 兩組患者治療前后生活質(zhì)量改變情況比較(n)

3 討論

MM是皮膚癌中最常見(jiàn)的類型，近年來(lái)已成為增長(zhǎng)最快的腫瘤之一，數(shù)據(jù)顯示2012年MM新增病例數(shù)為232 000，死亡例數(shù)為55 000，嚴(yán)重影響全球居民健康[6]。研究[7]表明，當(dāng)腫瘤負(fù)荷<1×106時(shí)，免疫治療可能取得較好的療效。因此先用手術(shù)方式減輕腫瘤負(fù)荷，再輔以免疫治療清除微小病灶，并提高自身免疫力以增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫，是一種很有希望的聯(lián)合治療方式。

DC細(xì)胞是目前已知最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，未成熟DC在抗原刺激后發(fā)育成成熟DC，成熟DC可將抗原呈遞給T細(xì)胞并能分泌細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)免疫應(yīng)答。臨床上利用DC治療腫瘤，主要通過(guò)體外用特異性腫瘤抗原刺激未成熟DC細(xì)胞，DC細(xì)胞識(shí)別并攝取抗原，發(fā)育成具有特異性抗原提呈功能的成熟DC細(xì)胞[8]。CIK細(xì)胞是由外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)有序的細(xì)胞因子體系誘導(dǎo)后獲得的新型的具有免疫效應(yīng)的細(xì)胞群，其兼具自然殺傷細(xì)胞的非限制性殺傷特點(diǎn)和T細(xì)胞的強(qiáng)抗腫瘤活性[9]。DC和CIK細(xì)胞均為腫瘤免疫方面重要的成員，兩者具有協(xié)同作用，負(fù)載特異性腫瘤抗原的DC細(xì)胞可介導(dǎo)CIK細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[10]。許多研究[11]表明DC疫苗聯(lián)合CIK治療比單獨(dú)使用DC或CIK更有效果。

本研究用特異性多肽組合負(fù)載DC細(xì)胞制備MM特異性DC疫苗，采用淋巴結(jié)區(qū)皮下注射(培養(yǎng)后第7天開(kāi)始回輸?shù)?次，每次隔1周，分4次輸完)，CIK細(xì)胞于靜脈回輸(培養(yǎng)后第9～21天分3次回輸完)，以保證CIK細(xì)胞對(duì)MM的特異性殺傷。治療時(shí)機(jī)選擇上，治療組均在手術(shù)切除原發(fā)灶后進(jìn)行，細(xì)胞治療療程不小于2個(gè)療程，對(duì)照組為單純行手術(shù)治療，術(shù)后予對(duì)癥治療。比較兩組患者在生存期、生活質(zhì)量及免疫功能等方面的變化。

結(jié)果顯示，治療組和對(duì)照組中位OS分別為49個(gè)月及27個(gè)月，中位PFS分別為19.5個(gè)月及13個(gè)月，1年生存率分別為84.4%及77.8%，3年生存率62.5%及29.6%，5年生存率37.5%及14.8%；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示治療組OS及3年生存率優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；該結(jié)果提示DC-CIK細(xì)胞治療雖未延長(zhǎng)患者術(shù)后PFS，但可延長(zhǎng)MM患者術(shù)后OS，可能提高患者的遠(yuǎn)期生存率，這與Zhang et al[10]關(guān)于DC-CIK細(xì)胞運(yùn)用于肝動(dòng)脈灌注化療栓塞術(shù)后肝癌患者的研究結(jié)果一致。兩組患者淋巴細(xì)胞亞群比較，治療后治療組患者T細(xì)胞比例有明顯升高，抑制性T細(xì)胞較前下降，CD8+T細(xì)胞較前上升，而對(duì)照組患者僅CD8+T細(xì)胞上升，余無(wú)明顯變化；抗腫瘤免疫中T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是最重要的成員，其數(shù)量一定程度反映機(jī)體的免疫功能，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells, Treg)是一類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其可通過(guò)抑制機(jī)體免疫反應(yīng)促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤患者預(yù)后緊密相關(guān)[12]。CD8+T細(xì)胞為效應(yīng)型細(xì)胞，一般認(rèn)為其為抑制性T細(xì)胞，含量越高，抑制性越強(qiáng)，免疫功能越弱[13]。但也有文獻(xiàn)[14]報(bào)道效應(yīng)型CD8+T與多種腫瘤的預(yù)后成正相關(guān)。治療組患者治療后總T淋巴細(xì)胞上升、Treg細(xì)胞比例下降，CD8+T淋巴細(xì)胞上升，而對(duì)照組僅CD8+T細(xì)胞較前上升，提示DC-CIK可以提高患者的免疫功能，這可能是DC-CIK延長(zhǎng)患者生存期的原因之一。此外DC-CIK細(xì)胞治療還可提高患者質(zhì)量，其較單純行手術(shù)治療的患者有明顯優(yōu)勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與劉洋 等[15]關(guān)于DC-CIK聯(lián)合化療治療MM的研究結(jié)果一致。

綜上所述，DC-CIK細(xì)胞免疫治療是一種安全有效的腫瘤治療方式，本研究為進(jìn)一步探討免疫治療提供了可靠的評(píng)估依據(jù)，但本研究并未探索其作用機(jī)制，后期可檢測(cè)樣本細(xì)胞因子、凋亡相關(guān)蛋白等的變化，進(jìn)一步深入驗(yàn)證。