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    干擾素α對乙型肝炎小鼠病理形態(tài)學及TGF-β1、ACT-A表達影響

    2020-12-05 12:11:04劉曉倩
    中國醫(yī)學裝備 2020年11期
    關鍵詞:乙肝纖維化炎性

    劉曉倩 喬 珺 張 蕾 張 新*

    由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的乙型肝炎(簡稱乙肝)在世界范圍內(nèi)具有極高的發(fā)病率,我國是乙肝發(fā)病大國,且一直是突出的公共衛(wèi)生問題[1]。干擾素α(interferon alpha,IFN-α)具有抗病毒及抗腫瘤的調(diào)節(jié)作用,在乙肝治療中應用較為廣泛[2]。此外有研究發(fā)現(xiàn),IFN-α的其他機制也可能具有治療乙肝及肝纖維化的作用。劉娜等[3]研究結果顯示,IFN-α可通過調(diào)節(jié)免疫提高對乙肝的療效。同時免疫炎性水平異常也是影響肝纖維化的重要因素,提示IFN-α也可能具有抑制乙肝纖維化的作用[4]。

    轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)及活化素A(activins A,ACT-A)均屬于TGF-β超家族,具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化的作用。有研究顯示,TGF-β1可通過調(diào)節(jié)肝星狀細胞促進肝纖維化,并且TGF-β1可能預示著更嚴重的肝組織損傷和纖維化程度[5-6]。ACT-A是一種由性腺分泌的肽類激素,具有調(diào)節(jié)纖維化的作用[7]。本研究主要分析IFN-α對乙肝小鼠肝組織病變及纖維化的影響,并檢測TGF-β1及ACT-A的變化,為將IFN-α更好應用于治療乙肝提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    選擇無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級飼養(yǎng)條件下BALB/c雌性小鼠共30只,鼠齡為8周,均購自中國動物實驗中心(Laboratory Animal Center);將生理狀況一致的健康30只小鼠分為3組,每組10只,分別為對照組、模型組和IFN-α組。

    1.2 儀器與試劑

    (1)儀器設備:采用ARCHITECT i2000SR酶標儀(美國雅培公司);ABI 7500 qPCR檢測系統(tǒng)(美國Life technologies公司);BX63電動熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

    (2)試劑:HBV及Hank調(diào)試劑(北京動物傳染病實驗研究中心);pKCMvint.IFN-α-2a及陰性對照質(zhì)粒pKCMvint(德國埃森醫(yī)院病毒研究所);血清谷氨酸轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、門冬氨酸轉移酶(aspartate transferase,AST)、HBV血清標志物HBeAg、HBsAg及IFN-α酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒均購自北京樂博公司;蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色和Masson染色試劑盒均購自武漢華美公司;Trizol試劑(美國Invitrogen公司);逆轉錄cDNA試劑盒及SYBR Green PCR Master Mix qPCR(定量PCR,quantitative qPCR)試劑盒(瑞士Roche公司);抗體(美國Abcam公司);膜聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美國Bio-Rad公司)。

    1.3 干預方法

    模型組和IFN-α組根據(jù)參考文獻[8]建立HBV感染模型,使用Hank調(diào)試劑將HBV稀釋至1×106個/ml,然后經(jīng)小鼠尾靜脈注射HBV溶液,注射劑量為10 ml/kg。對照組注射等劑量溶劑。IFN-α組[9]通過高壓尾靜脈注射pKCMvint.IFN-α-2a,每只10 μg,每2周一次,其中模型組注射等劑量的陰性對照。注射后第28 d檢測各指標。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 ELISA檢測

    注射后第28 d,采用ELISA檢測AST、ALT、HBeAg、HbsAg、IFN-α、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)的水平。對小鼠進行眼眶取血,利用離心設備,以6000 r/min的速度離心10 min,收集上層血清,通過磷酸緩沖液將其稀釋20倍后,根據(jù)ELISA試劑盒說明書加入試劑,檢測血清中HBV標志物HBeAg、HBsAg及IFN-α水平。

    1.4.2 染色

    注射后28 d將小鼠麻醉后處死,取出肝組織,室溫固定并包埋。將樣品切成4 μm厚的均勻薄片,進行脫蠟及水合,分別通過HE及Masson試劑進行染色,顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)和纖維化程度。

    1.4.3 RT-qPCR檢測

    使用Trizol 試劑獲得肝組織中總核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA),并檢測RNA濃度和純度。使用逆轉錄cDNA試劑盒逆轉錄1 μg RNA用于合成cDNA(42 ℃下60 min,70 ℃下5 min,然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒和RTqPCR檢測系統(tǒng)。進行qPCR實驗(在95 ℃/10 min,40個循環(huán),94 ℃/15 s,60 ℃/1 min,60 ℃/1 min,4 ℃保存)。比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達。磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和序列(U6)用于標準化。

    1.4.4 蛋白印跡方法(Western blot)

    采用Western Blot檢測肝組織中TGF-β1和ACT-A蛋白水平。在液氮的保護下裂解肝組織,在12000 rpm,4 ℃下離心15 min收集上清液,使用蛋白檢測方法(bicinchoninic acid,BCA)確定蛋白質(zhì)濃度。十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)(10%)電泳后進行PVDF膜轉及封閉。加入一抗后在室溫下振蕩2 h,后在4 ℃環(huán)境下孵育過夜,加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)參。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    使用SPSS19軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)評估組間差異,計量資料采用均值標準差()表示,兩兩比較使用t檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 小鼠一般情況比較

    對照組小鼠飲食、活動及排泄正常,皮毛有光澤且精神狀態(tài)正常。模型組小鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡,活動及飲食減少,部分出現(xiàn)腹水。IFN-α組的小鼠飲食和活動基本正常,皮毛較柔順,無腹水出現(xiàn)。

    2.2 小鼠血清HBV標志物及IFN-α水平比較

    模型組及IFN-α組小鼠血清中可檢測出明顯的HBV標志物HBeAg和HBsAg,并且IFN-α組血清HBeAg和HBsAg水平顯著低于模型組(t=6.132,t=5.986;P<0.05)。模型組和對照組IFN-α水平比較差異無統(tǒng)計學意義,IFN-α組的IFN-α水平顯著高于模型組(t=4.812,P<0.05),見表1。

    2.3 小鼠肝功能水平比較

    模型組小鼠血清肝功能指標ALT和AST顯著高于對照組(t=6.115,t=6.548;P<0.05),IFN-α組的ALT和AST水平顯著低于對照組(t=4.661,t=5.018;P<0.05),見表2。

    2.4 小鼠肝組織病理學形態(tài)變化

    對照組小鼠的肝組織中細胞形態(tài)完整,排列緊密,細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列,肝小葉結構完整且清晰。模型組小鼠的肝細胞出現(xiàn)顯著形變,細胞排列異常,出現(xiàn)假肝小葉,并且出現(xiàn)炎癥反應。IFN-α組小鼠的肝組織損傷程度較模型組顯著緩解,炎癥反應較輕,細胞排列基本緊密。各組小鼠肝組織病理學形態(tài)見圖1。

    2.5 小鼠肝組織纖維化情況比較

    Masson染色檢測中灰藍色為纖維組織,結果顯示對照組小鼠肝組織未發(fā)現(xiàn)明顯的纖維化現(xiàn)象,而模型組小鼠的肝組織出現(xiàn)大量的纖維化染色,IFN-α組小鼠的肝組織基本正常,并且僅有少量的纖維化染色,見圖2。

    2.6 小鼠炎性因子比較

    模型組小鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著高于對照組(t=5.771,t=6.238;P<0.05),IFN-α組的TNF-α和IL-6水平顯著低于模型組(t=5.823,t=5.339;P<0.05),見表3。

    表1 各組小鼠血清HBV標志物和IFN-α水平比較()

    注:表中IFN-α為干擾素α;HBeAg、HBsAg均為乙肝病毒血清標志物

    表2 各組小鼠血清ALT和AST水平比較(U/L,)

    表2 各組小鼠血清ALT和AST水平比較(U/L,)

    注:表中IFN-α為干擾素α;ALT為血清谷氨酸轉移酶;AST為門冬氨酸轉移酶

    圖1 HE染色檢測各組小鼠肝組織病理學形態(tài)(×400)

    圖2 Masson染色檢測各組小鼠肝組織纖維化情況(×400)

    表3 各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平比較(μg/L,)

    表3 各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平比較(μg/L,)

    注:表中IFN-α為干擾素α;TNF-α為腫瘤壞死因子α;IL-6為白細胞介素6

    表4 各組小鼠肝組織中TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平比較()

    表4 各組小鼠肝組織中TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平比較()

    注:表中IFN-α為干擾素α;TGF-β1為轉化生長因子β1;ACT-A mRNA為活化素A信使核糖核酸

    2.7 小鼠肝組織TGF-β1及ACT-A表達水平比較

    模型組小鼠肝組織中TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平顯著高于對照組(tTGF-β1=5.061,t=5.018;tACT-A=4.718,t=4.059;P<0.05),IFN-α組的TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平顯著低于模型組(tTGF-β1=6.224,t=4.389;tACT-A=5.973,t=5.389;P<0.05),見表4及圖3。

    圖3 各組小鼠肝組織中TGF-β1和ACT-A蛋白水平蛋白印跡電泳圖

    3 討論

    我國是乙肝發(fā)病大國,該疾病為患者、家庭和社會帶來了極大的負面影響。有研究發(fā)現(xiàn),慢性HBV可持續(xù)的損傷患者肝細胞,長期可能造成肝纖維化甚至肝硬化。有效清除病毒緩解肝損傷是治療乙肝的重要途徑。

    IFN-α最初在60年前被發(fā)現(xiàn),具有干擾病毒復制的能力,有研究已證明IFN-α可通過干擾素刺激基因影響HBV生命周期的多個步驟以抑制HBV復制[10]。此外,IFN-α還具有免疫調(diào)節(jié)活性,可調(diào)節(jié)對HBV感染的免疫反應促進HBV的清除[11]。臨床研究已發(fā)現(xiàn)IFN-α可用于治療HBV感染,但仍有部分患者對IFN-α反應不佳,在治療48周后,只有20~40%的患者出現(xiàn)HBeAg血清轉化,可能與不同的HBV基因型有關[12]。但也有研究顯示IFN-α具有治療乙肝的作用,并且具有一定的安全性[13]。Li等[14]的研究顯示對基線HBsAg水平較低的乙肝患者在早期使用聚乙二醇-IFN-α-2a治療可能會在96周后出現(xiàn)HBsAg降低。本研究中,根據(jù)參考文獻[8]通過經(jīng)小鼠尾靜脈注射HBV的方式建立乙肝模型,后根據(jù)參考文獻的常用方法尾靜脈注射pKCMvint.IFN-α-2a質(zhì)粒以提高IFN-α的表達水平[9]。建模后通過檢測小鼠血清中HBV標志物和IFN-α的水平發(fā)現(xiàn)模型組和IFN-α組的HBeAg和HbsAg顯著高于對照組,并且IFN-α組的IFN-α顯著高于模型組,而HBeAg和HbsAg顯著低于對照組。結合過往研究,本研究結果顯示了IFN-α對于感染HBV的小鼠具有顯著的抑制病毒復制的作用。

    為進一步研究IFN-α對乙肝小鼠肝損傷的影響,進一步分析了IFN-α對HBV感染小鼠模型病理形態(tài)學、血清炎性因子、TGF-β1和ACT-A水平的影響。結果顯示模型組的肝功能指標AST、ALT和炎性因子TNF-α及IL-6顯著高于對照組。IFN-α組的肝功能損傷程度和炎性因子水平顯著低于對照組。對于模型組,HE染色也可觀察到明顯的組織損傷和炎性反應,Masson染色可觀察到肝組織纖維化的加重,而IFN-α組的肝組織損傷程度和纖維化程度顯著低于對照組。有臨床研究顯示,IFN-α具有調(diào)節(jié)HPV感染的宮頸癌患者的免疫應答和抑制炎性反應[15]。劉萍等[16]的研究顯示,腺病毒肺炎嬰幼兒外周血中促炎細胞因子的水平與IFN-α負相關。此外,李學艷等[17]發(fā)現(xiàn),IFN-α可有效抑制皰疹性咽峽炎患者的炎性細胞因子的表達。而炎性因子也是誘發(fā)肝纖維化和肝硬化的主要因素。HBV感染可通過剪接特異性蛋白促進TGF-β1的表達并誘發(fā)肝癌的發(fā)生,而控制TGF-β1可延緩乙肝纖維化進展[18-19]。ACT-A是TGF-β超家族中的成員,感染引起的炎性反應也會引起ACT-a的升高,但關于ACT-A在乙肝肝損傷和肝纖維化中的機制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn),控制ACT-A的水平有助于緩解炎性反應保護肝組織[20-21]。

    4 結論

    本研究提示IFN-α可控制炎性因子及ACT-A和TGF-β1的水平,緩解肝組織損傷和纖維化。IFN-α不但可抑制HBV的復制,還可通過控制ACT-A及TGF-β1的表達緩解炎性反應,并減少HBV感染引起的肝組織損傷和纖維化。但關于IFN-α在乙肝肝纖維化中的作用機制仍需深入探究。

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