黑曲霉和酵母菌聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵涼茶渣提高酶活力的工藝研究

袁明貴 徐志宏 彭新宇 余丹妮 田 雅 周廷斤 唐興剛 向 蓉*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510640；2.廣東省前沿動(dòng)物保健有限公司，廣東廣州510640)

中國主流的飲用性涼茶是由雞蛋花、金銀花、菊花、涼粉草、夏枯草、甘草和布渣葉共7種植物藥物煎制而成。由于涼茶的提取過程更注重風(fēng)味成分的保留，造成涼茶渣仍具有與原藥材相似的營養(yǎng)成分[1]，是一種未被充分利用的生物資源。然而對于涼茶渣的資源化應(yīng)用研究比較缺乏，僅在直接作為飼料添加劑[1]或生物質(zhì)能源[2]方面有少量的報(bào)道。

涼茶渣中仍含有較高的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分等營養(yǎng)成分，可用作飼料添加劑[1]。但細(xì)胞壁中的纖維素、木聚糖和果膠阻礙了動(dòng)物對營養(yǎng)的消化利用。內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶的重要成分之一，可以從纖維素分子內(nèi)部水解糖苷鍵[3-4]，木聚糖酶[5-7]和果膠酶[8-9]可以分別高效降解抗?fàn)I養(yǎng)因子木聚糖和果膠，生成單糖或寡糖，從而促進(jìn)植物細(xì)胞壁的降解，三者在飼料和食品工業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用[10-12]。由于木聚糖酶和果膠酶的存在能夠更好地促進(jìn)纖維素酶降解底物[13]，因此發(fā)酵產(chǎn)物中不進(jìn)行分離的纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶更能促進(jìn)菌株轉(zhuǎn)化利用植物細(xì)胞[14]。黑曲霉是一種常見的無毒性曲霉屬真菌[15]，可以產(chǎn)生多達(dá)21種生物酶類[16-17]。酵母菌是工農(nóng)業(yè)最常用菌種之一，和黑曲霉共同發(fā)酵時(shí)具有良好的協(xié)同作用[18-20]。本文擬通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，探索利用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵涼茶渣生產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶的最佳工藝，為涼茶渣在飼料中的資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（GIM3.562）、產(chǎn)朊假絲酵母（GIM2.148），購于廣東省微生物菌種保藏中心；涼茶渣由國內(nèi)某一大型食品飲料公司提供。

5804R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，XS205DU電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)公司]，LDZX-50KB 立式高壓滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，Elx50酶標(biāo)儀(BioTek Instruments 公司)，BME生物顯微鏡(上海萊卡公司)。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA 培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g去皮，切成塊，煮沸30 min，紗布過濾，加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g，補(bǔ)水至1 000 ml，然后121 ℃濕熱滅菌20 min，趁熱制備菌種培養(yǎng)基。

固態(tài)涼茶渣培養(yǎng)基：將新鮮涼茶渣曬干粉碎，取粉末2 g，加入硫酸銨0.08 g、葡萄糖0.04 g、磷酸二氫鉀0.01 g、磷酸氫二鉀0.008 g、水8 g，121 ℃濕熱滅菌，滅菌后pH值為5.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在80%濕度，30 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，利用PDA 平板培養(yǎng)基將黑曲霉培養(yǎng)120 h，產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)24 h，兩種菌種都連續(xù)活化兩次。制備黑曲霉孢子和產(chǎn)朊假絲酵母菌種懸液，利用血球板計(jì)數(shù)法，測定各菌種濃度，混合菌種懸液，使每種菌種濃度都為2×109CFU/ml，將菌種按照10%接種量接種至固態(tài)涼茶渣培養(yǎng)基中，再根據(jù)各部分實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察發(fā)酵時(shí)間(48～144 h)、溫度(28～37 ℃及室溫)、含水量(65%～85%)、浸泡液pH值(5.0～9.0)、氮源種類(尿素、氯化銨、硫酸銨、豆粕和不補(bǔ)充氮源)和碳源種類(蔗糖、葡萄糖、糖蜜、α-乳糖和不補(bǔ)充碳源)共6 個(gè)因素對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶活力和木聚糖酶活力的影響。文中硫酸銨含量、葡萄糖含量、含水量以及接種量均按涼茶渣的干重計(jì)算。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以硫酸銨為氮源，葡萄糖為碳源，對含水量(A，60%、70%、80%)、發(fā)酵溫度(B，31、34、37 ℃)、浸泡液pH 值(C，7.0、8.0、9.0)、發(fā)酵時(shí)間(D，72、120、168 h)四個(gè)因素進(jìn)行三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化(表1)。

1.3.3 酶活力測試

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵培養(yǎng)物加入15 ml生理鹽水，震蕩后靜置過夜；經(jīng)過5 000 r/min 離心10 min，采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)顯色法檢測上清液中內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶活力[13，21-22]，沉淀烘干后質(zhì)量即為發(fā)酵樣品干重。

1.3.3.1 酶活力測試方法

取底物溶液0.4 ml，發(fā)酵上清液0.1 ml，混勻后，40 ℃水浴進(jìn)行酶促反應(yīng)10 min；然后加入DNS 0.5 ml，再次混勻后，煮沸10 min，以蒸餾水代替底物溶液為對照，測定特定波長吸光度，計(jì)算酶活力。

用0.2 mol/l的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH=5.0)，配制6.25 mg/ml羧甲基纖維素鈉溶液為底物，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定530 nm 的吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算內(nèi)切葡聚糖酶活力[13]；用0.2 mol/l 的磷酸氫二鈉-0.1 mol/l檸檬酸緩沖溶液(pH=5.0)，配制0.5%的果膠溶液為底物，以D-半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定540 nm的吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算果膠酶活力[21]；用0.1 mol/l 的磷酸氫二鈉-0.1 mol/l 檸檬酸緩沖溶液(pH=5.0)，配制0.5%的木聚糖溶液(pH=5.0)為底物，以木糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定550 nm的吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算木聚糖酶活力[22]。

1.3.3.2 酶活力計(jì)算

規(guī)定40 ℃時(shí)，每分鐘產(chǎn)生1 μmol 產(chǎn)物的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

式中：C0——對照的還原糖濃度(μmol/ml)；

C1——酶促反應(yīng)后還原糖濃度(μmol/ml)；

V1——參與反應(yīng)的酶溶液體積(ml)；

V2——酶溶液總體積(ml)；

t——酶促反應(yīng)時(shí)間(min)；

m——發(fā)酵樣品干重(g)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21 軟件對單因素實(shí)驗(yàn)中的同種酶活力進(jìn)行方差分析；并利用該軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析，以P<0.05作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)長對酶活力的影響

向涼茶渣補(bǔ)充4%硫酸銨，2%葡萄糖，溫度為31 ℃，含水量為80%，考察發(fā)酵時(shí)長在48～144 h內(nèi)變化對內(nèi)切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖1)顯示，三種酶活力均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增加；超過72 h后內(nèi)切葡聚糖酶和果膠酶的活力變化不顯著；木聚糖酶活力在96 h和120 h時(shí)無顯著差異。

圖1 發(fā)酵時(shí)長對酶活力的影響

時(shí)間對發(fā)酵效果具有顯著影響。如果發(fā)酵時(shí)間太短，菌體生長沒有達(dá)到穩(wěn)定期，使發(fā)酵不完全；發(fā)酵時(shí)間過長，營養(yǎng)供應(yīng)不足、菌種老化、產(chǎn)生有害的次級代謝產(chǎn)物，甚至造成菌體自溶[23]。經(jīng)過化學(xué)誘變選育的黑曲霉X1U4-1 在發(fā)酵玉米芯和麩皮(3:7)混合培養(yǎng)基時(shí)，纖維素酶活力84 h 時(shí)達(dá)到最大值，木聚糖酶活力68 h時(shí)達(dá)到最大值[16]。在利用黑曲霉GJ-2和酒精酵母J-1發(fā)酵橙子皮和麥麩生產(chǎn)果膠酶時(shí)，當(dāng)菌種同時(shí)接入發(fā)酵60 h 后，果膠酶活力不再顯著增加[19]。綜合考慮規(guī)?；幚硇剩瑢⒑罄m(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)的時(shí)間設(shè)定為72 h。

2.1.2 溫度對酶活力的影響

向涼茶渣補(bǔ)充4%硫酸銨，2%葡萄糖，含水量為80%，發(fā)酵72 h，考察溫度在28～37 ℃范圍內(nèi)以及室溫條件下，對三種酶活力的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖2)可以發(fā)現(xiàn)，溫度對木聚糖酶活力無顯著影響；而在34 ℃時(shí)的內(nèi)切葡聚糖酶活力顯著高于28 ℃時(shí)的活力；溫度在28～37 ℃范圍內(nèi)變化時(shí)，對果膠酶的活力無顯著影響。本實(shí)驗(yàn)是在廣州市的8月下旬進(jìn)行，室溫較高，適合黑曲霉與酵母菌的生長，因此涼茶渣室溫發(fā)酵時(shí)，三種酶活力也較強(qiáng)。盡管28 ℃發(fā)酵時(shí)，果膠酶活力較高，但是31 ℃時(shí)內(nèi)切葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力相對較高，考慮到南方氣溫偏高，并且黑曲霉在發(fā)酵過程中存在放熱現(xiàn)象，因此將后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)的溫度設(shè)定為31 ℃。在利用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵甜高粱酒糟和麥麩生產(chǎn)蛋白飼料，35 ℃時(shí)纖維素酶活力最大[24]，與本部分的內(nèi)切葡聚糖酶活力最大值對應(yīng)溫度基本一致。

圖2 溫度對酶活力的影響

2.1.3 含水量對酶活力的影響

含水量是指當(dāng)體系僅含有涼茶渣和水時(shí)，水的百分含量。在本部分實(shí)驗(yàn)中，向涼茶渣補(bǔ)充4%硫酸銨、2%葡萄糖，含水量在65%～85%范圍內(nèi)變化，31 ℃發(fā)酵72 h，考察含水量對三種酶活力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖3)顯示，當(dāng)含水量從65%增加到85%過程中，內(nèi)切葡聚糖酶活力和果膠酶活力基本上逐漸降低，其中80%和85%時(shí)的內(nèi)切葡聚糖酶活力顯著低于65%的內(nèi)切葡聚糖酶活力；80%和85%時(shí)的果膠酶活力顯著低于65%～75%的果膠酶活力；含水量對木聚糖酶活力沒有顯著影響。

圖3 含水量對酶活力的影響

基質(zhì)的含水量影響著胞外酶的分泌和轉(zhuǎn)移，影響氧的傳遞以及菌體生長。如果起始含水量太低，使菌種正常生長受到限制；含水量過高，基質(zhì)密度過大，透氣性和傳熱性較差，也不利于菌種生長。一般來說真菌發(fā)酵時(shí)需要相對更低的含水量，如利用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵三七渣生產(chǎn)蛋白飼料時(shí)，最優(yōu)含水量為70%[25]；在利用黑曲霉HN-1 發(fā)酵豌豆莢生產(chǎn)纖維素酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)含水量超過65%以后，纖維素酶活力顯著降低[17]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)當(dāng)含水量在65%～85%之間時(shí)，三種酶活力基本上隨著含水量的增加而降低。由于新鮮涼茶渣的含水量為79.45%[1]，接近80%，而本研究的目的是為涼茶渣的資源化利用提供參考，因此將后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)含水量均設(shè)定為80%。

2.1.4 浸泡液pH值對酶活力的影響

首先向計(jì)算量60%的蒸餾水中加入與其他實(shí)驗(yàn)PO43-等物質(zhì)的量的磷酸，利用3.0 mol/l的氫氧化鉀逐漸上調(diào)pH 值，形成pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的低濃度磷酸鹽緩沖體系，然后加入干涼茶渣進(jìn)行浸泡，再補(bǔ)充4%硫酸銨和2%葡萄糖，將每份樣品含水量均調(diào)節(jié)為80%后，31 ℃發(fā)酵72 h，考察浸泡液pH值對三種酶活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH 值對內(nèi)切葡聚糖酶活力影響不顯著；在pH 值為9.0 時(shí)，木聚糖酶和果膠酶活力顯著高于pH值為7.0時(shí)的酶活力(見圖4)。事實(shí)上，涼茶渣自身pH值為6.1，且具有一定pH值緩沖能力。當(dāng)用pH 值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的浸泡液浸泡涼茶渣，pH 值實(shí)測值分別為5.6、5.7、5.8、6.1 和7.2。盡管7.0 是浸泡液pH 值考察范圍的中間值，但是，可能不是菌種最適宜生長環(huán)境或產(chǎn)酶環(huán)境，導(dǎo)致果膠酶活力和木聚糖酶活力顯著降低?？紤]到規(guī)?；幚頃r(shí)，盡量簡化操作步驟，在后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)中依然向涼茶渣中補(bǔ)充0.5%磷酸二氫鉀和0.4%磷酸氫二鉀，使起始pH值為5.0。

圖4 浸泡液pH值對酶活力的影響

2.1.5 氮源種類對酶活力的影響

以2%葡萄糖為碳源，含水量為80%，向涼茶渣補(bǔ)充4%尿素、氯化銨、硫酸銨、豆粕四種氮源以及不補(bǔ)充氮源，31 ℃發(fā)酵72 h，考察氮源種類對三種酶活力的影響(見圖5)。結(jié)果顯示，與不補(bǔ)充氮源相比，尿素顯著提高了內(nèi)切葡聚糖酶活力，硫酸銨和氯化銨顯著地提高了內(nèi)切葡聚糖酶活力；氯化銨顯著降低了果膠酶活力；尿素、氯化銨和硫酸銨顯著提高木聚糖酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無機(jī)氮源比豆粕能夠更好地促進(jìn)涼茶渣發(fā)酵生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶。在利用黑曲霉SD-03發(fā)酵玉米芯生產(chǎn)木聚糖酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)多種無機(jī)氮源的發(fā)酵效果普遍優(yōu)于有機(jī)氮源[26]。絕大多數(shù)微生物都需要氮源合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，當(dāng)?shù)床蛔銜r(shí)，不利于微生物生長增殖。由于涼茶渣中氮源比較缺乏，因此不加任何氮源時(shí)，內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶活力相對較低。綜合考慮四種氮源和不補(bǔ)充氮源對三種酶活力的影響效果，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇向涼茶渣中補(bǔ)充4%硫酸銨作為氮源。

圖5 氮源種類對酶活力的影響

2.1.6 碳源對酶活力的影響

含水量為80%，以硫酸銨為氮源，向涼茶渣補(bǔ)充4%蔗糖、葡萄糖、糖蜜、α-乳糖以及不補(bǔ)充碳源，31 ℃發(fā)酵72 h，考察碳源種類對三種酶活力的影響(見圖6)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出四種碳源和不補(bǔ)充碳源對內(nèi)切葡聚糖酶活力無顯著影響；與不補(bǔ)充碳源和α-乳糖相比，蔗糖、葡萄糖和糖蜜顯著降低了果膠酶活力和木聚糖酶活力；不補(bǔ)充碳源和α-乳糖對果膠酶和木聚糖酶活力影響無顯著差異。由于黑曲霉發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的生物酶種類豐富，可以降解淀粉、纖維素等多糖生成單糖或寡糖，供自身生長和增殖需要，因此，利用黑曲霉發(fā)酵中藥渣時(shí)，可以不補(bǔ)充碳源[27-29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了不補(bǔ)充碳源時(shí)，黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵涼茶渣對纖維素酶活力和木聚糖酶活力無顯著影響，而且果膠酶活力優(yōu)于補(bǔ)充蔗糖、葡萄糖和糖蜜時(shí)的酶活力。

圖6 碳源種類對酶活力的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

盡管在發(fā)酵72 h的單因素實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)不補(bǔ)充碳源時(shí)內(nèi)切葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力與補(bǔ)充其他碳源時(shí)無顯著差異，且果膠酶活力顯著高于添加蔗糖、葡萄糖和糖蜜時(shí)的活力，但是考慮到在正交實(shí)驗(yàn)中，隨時(shí)間的延長，可能會(huì)對產(chǎn)酶具有較強(qiáng)的副作用，且考慮成本因素，未選擇酶活力較高的α-乳糖，而選擇添加2%的葡萄糖作為正交實(shí)驗(yàn)中碳源；并且在單因素實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間越長，含水量越低時(shí)，酶活力越高，因此在正交實(shí)驗(yàn)中將發(fā)酵時(shí)間延長至168 h，含水量降低至60%，探索更寬的時(shí)間和含水量范圍對三種酶活力的影響。同時(shí)，向涼茶渣中補(bǔ)充4%硫酸銨作為氮源，對含水量(A)、浸泡液pH 值(B)、溫度(C)以及發(fā)酵時(shí)間(D)四個(gè)因素進(jìn)行三水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見表1。

對表1 中的三種酶活力分別進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果見表2。從表2可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對內(nèi)切葡聚糖酶活力進(jìn)行正交分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)各因素對發(fā)酵效果的影響順序?yàn)闀r(shí)長>含水量>浸泡液pH值>溫度，其中時(shí)長對內(nèi)切葡聚糖酶活力具有顯著影響；最優(yōu)工藝為含水量為60%、浸泡液pH值為7.0、溫度為37 ℃、發(fā)酵120 h，即A1B1C3D2。

表1 涼茶渣固態(tài)發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)L9(34)

表2 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析

當(dāng)對木聚糖酶活力進(jìn)行正交分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)各因素對發(fā)酵效果的影響順序?yàn)榻菀簆H 值>含水量>時(shí)長>溫度，其中浸泡液pH值和含水量對木聚糖酶活力具有顯著影響；最優(yōu)工藝與產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的最優(yōu)工藝相同，也為含水量為60%、浸泡液pH值為7.0、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵120 h，即A1B1C3D2。

當(dāng)對果膠酶活力進(jìn)行正交分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)各因素對發(fā)酵效果的影響順序?yàn)闇囟?時(shí)長>浸泡液pH 值>含水量，其中溫度和時(shí)長對木聚糖酶活力具有顯著影響；最優(yōu)工藝為含水量為60%、浸泡液pH值為9.0、發(fā)酵溫度為37 ℃、發(fā)酵120 h，即A1B3C3D2。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于浸泡液pH 值對果膠酶活力影響不顯著(P=0.087)，且pH 值在7.0 和9.0 水平時(shí)，果膠酶活力分別為10.171 U/g 和10.426 U/g，差異不顯著，因此對果膠酶活力的正交分析結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，采用與內(nèi)切葡聚糖酶活力和木聚糖酶活力相同的工藝。經(jīng)過驗(yàn)證，含水量為60%，浸泡液pH 值為7.0，37 ℃發(fā)酵120 h(即A1B1C3D2)，發(fā)酵產(chǎn)物中內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠酶均獲得較高的活力，分別為(5.55±0.77)、(37.32±2.26)、(29.51±3.23) U/g，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。

3 討論

單一菌種進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，酶系往往不完全，而且發(fā)酵產(chǎn)物對酶具有反饋抑制作用，因此，選擇具有協(xié)同作用的菌種進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵是持續(xù)深入發(fā)酵的關(guān)鍵。譚顯東等[28]利用正交實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)酵三七渣生產(chǎn)蛋白的最佳菌種時(shí)，發(fā)現(xiàn)黑曲霉與產(chǎn)朊假絲酵母聯(lián)合發(fā)酵效果顯著優(yōu)于其他菌種組合，通過方差分析，發(fā)現(xiàn)黑曲霉和酵母菌，以及二者的相互作用對蛋白質(zhì)含量均有顯著影響。岳麗等[30]發(fā)現(xiàn)，利用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母聯(lián)合發(fā)酵甜高粱酒糟生產(chǎn)蛋白時(shí)，與單一菌種相比，蛋白質(zhì)含量顯著提高，纖維素含量顯著降低。黑曲霉發(fā)酵時(shí)可以分泌如纖維素酶等多種酶類，降解大分子糖類化合物生成單糖，過多的單糖對酶產(chǎn)生抑制作用，而單糖是酵母菌的優(yōu)質(zhì)碳源，這樣利用黑曲霉和酵母菌聯(lián)合發(fā)酵，可以相互促進(jìn)，產(chǎn)生協(xié)同作用。黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母的協(xié)同作用是本研究的基礎(chǔ)。

岳麗等[24]利用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母聯(lián)合發(fā)酵甜高粱酒糟和麥麩生產(chǎn)蛋白飼料，經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化，31 ℃發(fā)酵6.25 d 后，纖維素酶活力達(dá)到1.33 U/g。本研究利用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母對涼茶渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，在最優(yōu)條件下內(nèi)切葡聚糖酶活力為(5.55±0.77) U/g。二者的區(qū)別主要是由于前者以濾紙為底物，測試的是纖維素酶的整體活力，而本研究主要是以纖維素鈉為底物，測試的是內(nèi)切葡聚糖酶的活力；同時(shí)發(fā)酵菌種、基質(zhì)和條件的不同，使二者差異較大。周杰民等[19]利用黑曲霉GJ-2 和酒精酵母J-1 發(fā)酵橙子皮和麥麩生產(chǎn)果膠酶，經(jīng)過條件優(yōu)化后，果膠酶活力達(dá)到188.01 U/ml，而本研究的果膠酶活力為(29.51±3.23) U/g；張水龍[31]利用黑曲霉CICC40616 發(fā)酵含有豆粕和木聚糖的培養(yǎng)基，經(jīng)優(yōu)化后木聚糖酶活力為82.43 U/ml，而本研究的木聚糖酶活力為(37.32±2.26) U/g?？赡苁沁@兩個(gè)實(shí)驗(yàn)是以生產(chǎn)果膠酶活力或木聚糖酶為目的，選擇了產(chǎn)目標(biāo)酶的專一菌株，而本文以黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母固態(tài)發(fā)酵涼茶渣，同時(shí)產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶，以期三者能夠協(xié)調(diào)高效地降解植物細(xì)胞壁。

4 結(jié)論

本文利用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母的協(xié)同作用，對涼茶渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)含水量為60%、浸泡液pH值為7.0、溫度為37 ℃、發(fā)酵120 h，是生產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠酶的較合適工藝，在此工藝下，三種酶活力均較高，分別為(5.55±0.77)、(37.32±2.26)、(29.51±3.23) U/g。本研究為涼茶渣在飼料中的資源化利用提供了參考。