酵母、乳酸菌作為發(fā)酵劑對天麻總酚含量及還原能力的影響

蔡倪 許譯文 張東亞 李靜雯 許曌昕 郭啟鵬 曾榮妹

摘 要：本文以釀酒酵母、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑對天麻進行發(fā)酵，研究發(fā)酵和浸提作用對天麻素、對羥基苯甲醇、總酚含量和還原力的影響，以期對天麻酒、酵素的開發(fā)提供參考。結(jié)果表明，酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵過程能有效促進對羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化為天麻素，發(fā)酵劑對天麻素和對羥基苯甲醇總含量有不同影響;添加發(fā)酵劑與對照組比較，總酚含量均降低，釀酒酵母對總酚含量降低的影響更大;酵母和乳酸菌參與發(fā)酵會影響天麻的還原能力，在0.1～0.4 mL的體積范圍內(nèi)，只有釀酒酵母作用的天麻發(fā)酵液還原能力最強。

關(guān)鍵詞：天麻;酵母;乳酸菌;發(fā)酵;酚類

Abstract：In this paper， Saccharomyces cerevisiae， lactic acid bacteria bulgaricus and Streptococcus thermophilus were used as fermentation agents to ferment Gastrodia elata Blume. The effects of fermentation and extraction on the contents of gastrodin， 4-Hydroxybenzyl alcohol， total phenol and reducing power were studied in order to provide reference for the development of Gastrodia elata wine and fermented beverage. The results showed that Ethanol Fermentation and lactic acid fermentation could effectively promote the conversion of 4-Hydroxybenzyl alcohol to gastrodin， and the fermentation agents had different effects on the total contents of gastrodin and 4-Hydroxybenzyl alcohol; compared with the control group， the content of total phenols was decreased， and Saccharomyces cerevisiae had more influence on total phenol content; the participation of yeast and lactic acid bacteria in the fermentation could affect the reducing ability of Gastrodia elata Blume. In the volume range of 0.1～0.4 mL， Saccharomyces cerevisiae had the strongest effect on the reducing force of Gastrodia elata fermentation.

Key words：Gastrodia elata Blume; Yeast; Lactic acid bacteria; Fermentation; Phenols

中圖分類號：R284

天麻（Gastrodia elata Blume）中的酚類成分是已知化學(xué)成分中占比最高的成分類群，包括酚類、酚苷類、酚醚類、酚醛類和含硫酚類[1]。天麻素（Gastrodin，GAS）、對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HBA）等主要酚類成分具有抗抑郁、改善記憶、鎮(zhèn)靜催眠等作用[2-4]，天麻的總酚含量還與其抗氧化能力密切相關(guān)[5]。國衛(wèi)食品函〔2019〕311號中提出對天麻開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)生產(chǎn)經(jīng)營試點工作，在食藥兼用、保健功能的開發(fā)方面，天麻發(fā)酵型保健酒[6-9]的研究較多。發(fā)酵能將原料中大部分活性成分保留，還能增加微生物代謝合成的有益物質(zhì)，有利于人體健康。酵素同樣是一種具有保健功能的發(fā)酵產(chǎn)品。近年來，具有藥食兩用植物保健功能的酵素產(chǎn)品開發(fā)成為新的研究趨勢[10]。

酵母菌和乳酸菌是釀酒和酵素生產(chǎn)中重要的兩類發(fā)酵微生物[11-13]。在發(fā)酵過程中，酵母菌主要進行酒精發(fā)酵，并合成多種風(fēng)味物質(zhì);而乳酸菌主要進行乳酸發(fā)酵，能產(chǎn)生氨基酸和各種維生素，提高酚類物質(zhì)生物利用率[14]。目前有關(guān)浸提和酵母、乳酸菌發(fā)酵對天麻的活性成分的影響報道較少，本文以天麻素、對羥基苯甲醇、總酚和還原力為考察指標(biāo)，探究釀酒酵母和保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌對天麻浸提發(fā)酵液中幾種指標(biāo)的影響，為天麻酒、酵素的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

貴州大方烏天麻、白砂糖：市售優(yōu)質(zhì)品;高活性果酒干酵母、乳酸菌粉（保加利：亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）：安琪酵母股份有限公司。

三氯化鐵、抗壞血酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;沒食子酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;無水碳酸鈉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司;鐵氰化鉀（≥99.5%）、三氯乙酸，上海麥克林生化科技有限公司;磷酸：天津市富宇精細(xì)化工有限公司;以上試劑均為分析純。天麻素（≥98%），Sigma-Aldrich公司;羥基苯甲醇（111970-201702，≥99.4%），中國食品藥品檢定研究院;PBS磷酸鹽緩沖液、1N福林酚

（BR級），Solarbio公司;乙腈（LC級），美國Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

安捷倫1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、GTR16-2高速冷凍離心機（北京時代北利離心機有限公司）、FA2004型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、DXF-02C100粉碎機（廣州市大祥電子機械設(shè)備有限公司）、SPX-150C恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、0.22 μm針頭過濾器（天津領(lǐng)航實驗設(shè)備股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

將烏天麻塊莖用粉碎機粉碎，過60目篩得天麻粉。稱取一定量的天麻粉和白砂糖，分成等重的4份，每份與30倍的水混合攪拌均勻。滅菌，快速冷卻至室溫，置于超凈工作臺紫外照射30 min。其中3份分別加入等量的酵母、乳酸菌、酵母和乳酸菌（比例為1∶1），混勻。4份樣品置于40 ℃培養(yǎng)箱若干小時，取出過濾，濾液滅菌冷卻后測定指標(biāo)。未加發(fā)酵劑的樣品D為對照組，見表1。

1.2.2 天麻素和對羥基苯甲醇含量的測定

參考2015版《中華人民共和國藥典》中的RP-HPLC

法測定天麻素和對羥基苯甲醇的含量[15]。

（1）對照品溶液的配制。精密稱定天麻素對照品、對羥基苯甲醇對照品，加乙腈-水（3∶97）混合溶液制成每1 mL含天麻素50 μg、對羥基苯甲醇25 μg的混合溶液。

（2）樣品和對照品的測定。色譜條件：檢測波長220 nm，進樣量10 μL，流速1 mL·min-1，柱溫25 ℃，

色譜柱： Hypersil BDS C18色譜柱（250×4.6 mm，

5 μm，130A），流動相乙腈-0.05%磷酸（體積比

為3∶97）。

取適量樣品10 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm濾膜待上機測定。用進樣器分別吸取10 μL樣品、天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液、對羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下，用高效液相色譜儀測樣品及對照品的吸收峰。

1.2.3 總酚含量的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。采用福林-酚法測定[16]。以沒食子酸濃度x（mg·mL-1）對吸光度y回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=3.453 6x+0.008 8，R2=0.995 9，如圖1所示。

（2）樣品測定。分別精確量取0.10 mL待測樣品于10 mL試管中，加入1.0 mL福林-酚試劑，1 min后加入15%碳酸鈉溶液1.5 mL，然后加水使總體積為4.5 mL，混勻，75 ℃水浴避光反應(yīng)10 min，冷卻，在760 nm處測定吸光度，平行測定3次，取平均值，以蒸餾水為參比溶液。樣品的總酚含量以沒食子酸濃度為等價物表示。

1.2.4 還原力的測定

分別精確量取0.10、0.20、0.30、0.40 mL和0.50 mL

樣品于編號不同的試管中，加水至3.0 mL，加入1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6，0.2 mol·L-1），再加入1%的鐵氰化鉀1 mL，混合物置于50 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min，

然后加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL，混合均勻后取上清液1 mL，加入0.1%三氯化鐵0.2 mL室溫下反應(yīng)。10 min后在700 nm處測定其吸光度，以蒸餾水為參比溶液，以0.1 mg·mL-1的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液做對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的天麻素和對羥基苯甲醇含量

混合標(biāo)樣和4種樣品的天麻素、對羥基苯甲醇HPLC圖譜如圖2、圖3所示。

根據(jù)峰面積計算出4種樣品的天麻素、對羥基苯甲醇的含量見表2。結(jié)果表明，與未添加發(fā)酵劑相比，酵母和乳酸菌參與發(fā)酵能提高天麻素占比，酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵過程能有效將對羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化為天麻素，釀酒酵母的轉(zhuǎn)化作用更加明顯;有酵母參與發(fā)酵的天麻浸提液中天麻素和對羥基苯甲醇的總含量明顯降低，只存在酵母作用的樣品A總含量減少了1.895 mg/100 g，這可能是因為酵母的生長繁殖會消耗部分天麻素和對羥基苯甲醇;只存在乳酸菌作用的樣品B總含量增加了0.637 mg/100 mg，說明乳酸發(fā)酵過程可提高天麻素和對羥基苯甲醇的浸出。

2.2 天麻樣品的總酚含量

由圖4可知，不同發(fā)酵劑對天麻浸提液的影響較大。與未添加發(fā)酵劑相比，當(dāng)發(fā)酵和浸提同時進行時，酵母和乳酸菌的發(fā)酵作用會降低天麻浸提液中的總酚含量?？偡雍繕悠稤>樣品B>樣品C>樣品A，未添加發(fā)酵劑的樣品總酚含量最高，達(dá)0.210 mg·mL-1，受酵母的酒精發(fā)酵過程影響，樣品A的總酚含量最低，含量為0.154 mg·mL -1，結(jié)果與發(fā)酵蘋果酒的總酚變化規(guī)律相似[17]。這可能與發(fā)酵液中溶氧導(dǎo)致多酚氧化含量降低和微生物發(fā)酵速率有關(guān);另外，酵母具有促進酚類轉(zhuǎn)化的作用[18]，并且設(shè)定的發(fā)酵溫度更加有利于乳酸菌的生長繁殖。

2.3 樣品的還原力

4種樣品的吸光度與0.1 mg·mL-1的維生素C吸光度對比見表3，吸光度越大，表明還原力越強。結(jié)果表明，4種樣品均有一定的還原力。用量為0.1 mL時，4種樣品和濃度為0.1 mg·mL-1的維生素C溶液的吸光度相差較小，還原能力接近。隨著體積用量的增多，吸光度增大，還原力增加，樣品A、B、C和維生素C的增勢變緩。在用量≤0.4 mL時，只有酵母作用的樣品A還原能力最強，吸光度為0.536;而體積達(dá)0.5 mL時，樣品D的還原能力最強，吸光度為0.630。乳酸菌作用的樣品B還原力在4種樣品中最弱。說明天麻浸提液中具有還原性的物質(zhì)不只是天麻素和對羥基苯甲醇，乳酸菌的生長繁殖可能會消耗部分還原性物質(zhì)。還原力樣品A>樣品C>樣品B，酵母和乳酸菌參與發(fā)酵并不一定增強天麻浸提液的還原力。

3 結(jié)論

酒精發(fā)酵和乳酸發(fā)酵過程能有效促進對羥基苯甲醇轉(zhuǎn)化為天麻素。釀酒酵母參與發(fā)酵會降低天麻素和對羥基苯甲醇的總含量，而保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的生長繁殖使天麻發(fā)酵液呈酸性（pH≤3.65），能增加天麻素和對羥基苯甲醇的總浸出量。

實驗中添加酵母、乳酸菌發(fā)酵劑的天麻發(fā)酵液與對照組相比，總酚含量均降低。釀酒酵母比保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌對總酚含量降低的影響更大。

酵母和乳酸菌參與發(fā)酵會影響天麻的還原能力。當(dāng)體積為0.1 mL時，實驗中4種天麻樣品的還原力差異較小，并且與0.1 mg·mL-1維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液還原力相當(dāng)。隨著體積的增加，還原力均呈現(xiàn)增大的趨勢。

在0.1～0.4 mL的體積范圍內(nèi)，只有釀酒酵母作用的天麻發(fā)酵液還原能力最強。

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