高效液相色譜法測(cè)定辣椒粉中蘇丹紅I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的不確定度評(píng)定

宗凌麗 應(yīng)月 孫瑞

摘 要：本文采用液相色譜法對(duì)辣椒粉中蘇丹紅含量測(cè)定進(jìn)行不確定度研究，建立不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型，對(duì)檢測(cè)過程中各來源產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行分析，得到該方法的擴(kuò)展不確定度。結(jié)果表明辣椒粉中蘇丹紅不確定度評(píng)定結(jié)果為蘇丹紅I0.896±0.046 4 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅱ0.701±0.018 8 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅲ0.847±0.021 5 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅳ0.624±0.018 3 mg·kg-1。

關(guān)鍵詞：辣椒粉;蘇丹紅I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;不確定度

Abstract：In this paper， the uncertainty of determination of Sudan red in pepper powder was studied by HPLC， and the mathematical model of uncertainty evaluation was established. The uncertainty of each source in the detection process was analyzed， and the expanded uncertainty of this method was obtained. The results showed that the uncertainty evaluation results of Sudan red in pepper powder were Sudan I 0.896 ± 0.046 4 mg·kg-1， Sudan II 0.701±0.018 8 mg·kg-1， Sudan III

0.847 ± 0.021 5 mg·kg-1， Sudan IV 0.624 ± 0.018 3 mg·kg-1.

Key words：Chili powder; Sudan I， II， III， IV; Uncertainty

中圖分類號(hào)：O657.7

蘇丹紅是一種人工合成的親脂性偶氮染料，主要包括I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4種類型。使用蘇丹紅染色后的食品顏色非常鮮艷且不易褪色，能引起人們強(qiáng)烈的食欲，一些不法企業(yè)把蘇丹紅添加到食品中。經(jīng)毒理學(xué)研究表明，蘇丹紅具有致突變性和致癌性，蘇丹紅I在人類肝細(xì)胞研究中顯示具有可能致癌的特性，在我國(guó)禁止使用于食品中。在發(fā)現(xiàn)蘇丹紅在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物為可能致癌的胺類物質(zhì)后，歐盟等國(guó)家已禁止其作為色素在食品中添加[1-2]。因此對(duì)蘇丹紅的檢測(cè)技術(shù)提出了很高的要求[3]。測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性與測(cè)量結(jié)果的參數(shù)，也是對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)真實(shí)性的客觀反映和判定測(cè)量結(jié)果可靠程度的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)室研究了GB/T 19681-2005《食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》測(cè)定食品中蘇丹紅的不確定度，參考JJ 1059.1-2012《測(cè)量不確定評(píng)定與表示》[4]和JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[5]測(cè)量和評(píng)定其不確定度，為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制提供科學(xué)、準(zhǔn)確的依據(jù)，為食品中的蘇丹紅含量測(cè)定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（阿爾塔，100 μg·mL-1，純度99.6%）、蘇丹紅Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（曼哈格，100 μg·mL-1，純度85.0%）、蘇丹紅Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（曼哈格，100 μg·mL-1，

純度90.7%）和蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（曼哈格，100 μg·mL-1，

純度78.6%）;玻璃量器：經(jīng)檢定均為A級(jí);丙酮、乙腈、正己烷均為色譜純;無水硫酸鈉為分析純。

1.1.2 儀器

Agilent1260液相色譜儀（DAD檢測(cè)器），美國(guó)安捷倫科技有限公司;METTLER-TOLEDO ME503T電子天平，梅特勒-托利多公司;色譜柱：Agilent? Eclipse plus-C18 4.6 mm×150 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.1.3 測(cè)定條件

測(cè)定的環(huán)境條件：溫度≤30 ℃，相對(duì)濕度≤50%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

紅辣椒粉等粉狀樣品：稱取1～5 g（準(zhǔn)確至0.001 g）

樣品于三角瓶中，加入10～30 mL正己烷，超聲

5 min，過濾，用10 mL正己烷洗滌殘?jiān)鼣?shù)次，至洗出液無色，合并正己烷液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL以下，慢慢加入氧化鋁層析柱中，為保證層析效果，在柱中保持正己烷液面為2 mm左右時(shí)上樣，在全程的層析過程中不應(yīng)使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗濃縮瓶，一并注入層析柱?？刂蒲趸X表層吸附的色素帶易小于0.5 cm，待樣液完全流出后，視樣品中含油類雜質(zhì)的多少用10～30 mL正己烷洗柱，直至流出液無色，棄去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60 mL洗脫，收集、濃縮后，用丙酮轉(zhuǎn)移并定容至5 mL，經(jīng)0.45 ?m有機(jī)濾膜過濾后待測(cè)。

1.2.2 色譜條件

用反相高效液相色譜——紫外可見光檢測(cè)器進(jìn)行色譜分析，檢測(cè)波長(zhǎng)：蘇丹紅I 478 nm;蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ520 nm，其峰面積與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。

1.2.3 檢測(cè)方法

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取蘇丹紅I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，用乙腈稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液。以保留時(shí)間定性、峰面積定量、外標(biāo)法計(jì)算蘇丹紅含量。

1.2.4 建立數(shù)學(xué)模型

測(cè)量不確定度數(shù)學(xué)模型如下所示：

（1）

式（1）中，X為供試樣品中蘇丹紅含量，mg·kg-1;C為供試溶液中蘇丹紅的濃度，μg·mL-1;V為供試品定容的總體積，mL;m為供試樣品質(zhì)量，g。

2 不確定度來源分析?

2.1 不確定度的來源

液相色譜法測(cè)定食品中蘇丹紅含量其不確定度來源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液及配制過程、樣品稱樣量、樣品最終定容體積、色譜峰面積、回收率等引入的不確定度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及其配制過程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)不確定度urel（C1）

根據(jù)蘇丹紅I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（阿爾塔，100 μg·ml-1，純度99.6%）、蘇丹紅Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（曼哈格，100 μg·mL-1，純度85.0%）、蘇丹紅Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（曼哈格，100 μg·mL-1，純度90.7%）和蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（曼哈格，

100 μg·mL-1，純度78.6%），其標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度u（C1），見表1。根據(jù)公式（1）得到蘇丹紅各組分的相對(duì)不確定度urel（C1），按正態(tài)分布計(jì)算，k=2，結(jié)果見表1。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C0）

用1.0 mL移液管移取蘇丹紅I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ準(zhǔn)溶液

1.0 mL，置于潔凈100 mL容量瓶中，乙腈定容，混勻，濃度為1.0 μg·mL-1。根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，用容量允差計(jì)算不確定度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的不確定度。

（1）玻璃量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（V）。

1.0 mL移液管校準(zhǔn)容量允差為±0.007 mL，假設(shè)為均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

100 mL容量瓶校準(zhǔn)容量允差為±0.10 mL，假設(shè)為均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）環(huán)境溫度變化引入的不確定度u（t）。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度變化在±3 ℃范圍中?T=3，溶劑的膨脹系數(shù)a=1.37×10-3，則溫度變化引入的不確定度：

合成不確定度

相對(duì)合成不確定

根據(jù)公式（2）計(jì)算有蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)溶液配制所引入的相對(duì)不確定度urel（C0）。

（2）

2.3 樣品制備過程中引入的不確定度

2.3.1 樣品稱樣量引入的相對(duì)不確定度urel（m）

稱取1.000 g樣品，使用天平的最大允許誤差為

1 mg，以1 g稱樣量計(jì)算，按均勻分布計(jì)算，k=。由稱量引入的相對(duì)不確定度為：

2.3.2 樣品最終定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）

5.0 mL容量瓶允差?（V）為±0.02 mL，按矩形分布，則5.0 mL容量瓶不確定度為：

環(huán)境溫度變化引入的不確定度：

樣品最終定容體積的相對(duì)不確定度

2.3.3 色譜峰面積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（A0）

分別對(duì)各組分的蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為

1.0 μg·mL-1）進(jìn)行6次平行測(cè)定，得到峰面積，結(jié)果見表2。根據(jù)公式（3）計(jì)算蘇丹紅準(zhǔn)溶液色譜峰面積引入的標(biāo)準(zhǔn)偏差u（A0）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（A0），結(jié)果見表3。

（3）

（4）

2.3.4 回收率引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（R）

稱取辣椒粉樣品6份，按1 mg·kg-1水平添加蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行6次加標(biāo)試驗(yàn)，根據(jù)貝賽爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S（R）和測(cè)量平均值R，根據(jù)

計(jì)算回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（R），結(jié)果見表4。

2.4 合成不確定度

根據(jù)以上不確定度評(píng)定過程，合成食品中蘇丹紅測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見表5，結(jié)果如下：

2.5 擴(kuò)展不確定度u

取k=2（置信度為95%）時(shí)，計(jì)算蘇丹紅的擴(kuò)展不確定度u，結(jié)果見表6。

2.6 測(cè)量結(jié)果

當(dāng)取樣量為1.0 g，k=2（置信度為95%）時(shí)，液色譜法檢測(cè)辣椒粉中蘇丹紅I、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ，當(dāng)測(cè)得濃度為蘇丹紅I 0.896 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅱ0.701 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅲ0.847 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅳ0.624 mg·kg-1，其擴(kuò)展不確定度為蘇丹紅I

0.046 4 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅱ 0.018 8 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅲ0.021 5 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅳ0.018 3 mg·kg-1。測(cè)定結(jié)果表示為蘇丹紅I0.896±0.046 4 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅱ0.701±

0.018 8 mg·kg-1、蘇丹紅Ⅲ0.847±0.021 5 mg·kg-1、

蘇丹紅Ⅳ0.624±0.018 3 mg·kg-1。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜法對(duì)辣椒粉中蘇丹紅含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)合實(shí)驗(yàn)過程及計(jì)算結(jié)果可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度是本研究方法測(cè)量不確定度的主要來源，其次是樣品的定容體積、測(cè)定結(jié)果峰面積、回收率等引入的不確定度。因此需控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)主要包括隨時(shí)調(diào)整儀器使其達(dá)到最佳狀態(tài)，同時(shí)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程，分析人員應(yīng)熟練掌握樣品各項(xiàng)處理步驟，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，從而減少測(cè)定結(jié)果的不確定度。

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