基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討活血化瘀藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機(jī)制

丁 杰，倪喆鑫，程 雯，俞超芹 （海軍軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海 200433）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）是臨床上 最為常見的慢性婦科疾病之一，以慢性盆腔疼痛、月經(jīng)紊亂和不孕為主要的臨床表現(xiàn)。EM 本質(zhì)是血瘀證，臨床治療時以活血化瘀為主，常用的藥物有桃仁、紅花、澤蘭、丹參、益母草、川牛膝、王不留行等，能夠有效緩解患者痛經(jīng)、非經(jīng)期盆腔痛等癥狀[1]。

目前活血化瘀類中藥對EM 治療的具體機(jī)制不是很清晰，其針對的靶點(diǎn)也不是很明了。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將生物網(wǎng)絡(luò)作為研究對象，探究藥物、靶點(diǎn)、疾病之間的聯(lián)系，系統(tǒng)完整地研究藥物的機(jī)制，可展現(xiàn)出藥物對于多個靶點(diǎn)、多個通路不同影響。因?yàn)楹椭嗅t(yī)整體觀念天然契合，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥研究中[2-3]。在本研究中，筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究活血化瘀類中藥治療EM 的作用機(jī)制，構(gòu)建“化合物-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并初步探析何種活血化瘀藥在EM 治療中更具優(yōu)勢，為臨床用藥以及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活血化瘀類中藥確認(rèn)

根據(jù)衛(wèi)生部“十一五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》分類，確認(rèn)桃仁、紅花、澤蘭、丹參、益母草、川牛膝、王不留行七味活血化瘀藥為本次主要研究對象。

1.2 中藥有效成分以及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

利用中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫TCMSP 平臺（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），檢索七味中藥所含活性成分。依據(jù)數(shù)據(jù)庫指南要求，將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 以及類藥性（druglike，DL）≥0.18 作為篩選條件，對活性成分進(jìn)行篩選[4]。OB 值是評價藥物能否發(fā)揮藥效的重要藥動學(xué)參數(shù)，DL 值是指化合物與所有已知藥物之間的相似程度。上述2 個參數(shù)是評價中藥化學(xué)成分吸收、分布、代謝、排泄的關(guān)鍵參數(shù)。獲得符合OB、DL 參數(shù)有效活性成分后，利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢各有效活性成分對應(yīng)相關(guān)靶點(diǎn)。利用Venn 圖工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）對藥物化學(xué)成分以及相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行共同點(diǎn)分析，尋找活血化瘀中藥共有成分和作用靶點(diǎn)。

1.3 EM 相關(guān)靶點(diǎn)基因確認(rèn)

利用美國國立生物技術(shù)信息中心Gene 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）將所獲靶點(diǎn)信息轉(zhuǎn)換成基因名稱。查詢GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，獲得與EM 相關(guān)基因靶點(diǎn)。最后將每種中藥的作用靶點(diǎn)對應(yīng)的Gene Symbol 與EM 基因進(jìn)行比對，獲得每種中藥可能影響EM 的相關(guān)基因，利用Cytoscape 3.6.0 軟件構(gòu)建化合物－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)[5]。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步研究靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，將活血化瘀藥共同靶點(diǎn)上傳至線上軟件 STRING(http://string db.org)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。物種選擇為Homosapiens，minimum required interaction score 調(diào)整為highest confidence，隱藏網(wǎng)絡(luò)圖中游離節(jié)點(diǎn)，獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 KGEE 通路分析

利用 KEGG 數(shù)據(jù)庫（https://www.keg g.jp/）查詢每種中藥針對EM 的相關(guān)基因，獲得相關(guān)KEGG 通路信息。篩選各中藥KEGG 通路中相關(guān)基因富集情況，并利用Prism 8.0 軟件繪制通路靶點(diǎn)富集熱圖。

2 結(jié)果

2.1 活血化瘀類中藥有效成分及對應(yīng)靶點(diǎn)的獲取

按照要求從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出各中藥有效成分，刪除重復(fù)項(xiàng)，共有94 種有效成分（supplementary materials table S1）。其中丹參有效活性成分達(dá)到65 個，而澤蘭有效活性成分只有2 個。未能發(fā)現(xiàn)七味活血化瘀藥共同有效成分，但β-谷固醇為川牛膝、紅花、桃仁、澤蘭所共有，槲皮素為川牛膝、紅花、王不留行、益母草所共有，是涉及活血化瘀類中藥最多的2 種有效成分（supplementary materials table S2）。與此同時，我們找到了七味中藥所共有的19 個作用靶點(diǎn)（表1），包括孕酮受體（progesterone receptor）、前列腺素G/H 合成酶 1（prostaglandin G/H synthase 1）、前列腺素 G/H 合成酶 2（prostaglandin G/H synthase 2）、凋亡調(diào)節(jié)劑 Bcl-2（apoptosis regulator Bcl-2）、核受體共激活劑（nuclear receptor coactivator 2）等。

表1 七種活血化瘀中藥共有的 19 個靶點(diǎn)

2.2 EM 相關(guān)靶點(diǎn)確認(rèn)

利用人類基因數(shù)據(jù)庫查找EM 作用靶點(diǎn)，與七味中藥有效成分對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)紅花所含相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)量最多，達(dá)到103 個；而桃仁、澤蘭所含相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)量最少，為14 個（圖1A）；王不留行所含相關(guān)靶點(diǎn)占有效成分作用靶點(diǎn)比例最高，為54.7%；而桃仁最低，為29.8%（圖1B）。經(jīng)過去重處理后，七味中藥所含EM 相關(guān)靶點(diǎn)共119 個（supplementary materials table S3）。利用 Cytoscape3.6.0 軟件進(jìn)行成分－靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析，獲得圖2，其中共計(jì)216 個節(jié)點(diǎn)，其中黃色節(jié)點(diǎn)為活血化瘀藥有效活性成分，而藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表EM 相關(guān)靶點(diǎn)。利用軟件自帶分析功能，對于網(wǎng)絡(luò)各節(jié)點(diǎn)度值進(jìn)行分析，網(wǎng)絡(luò)中某些節(jié)點(diǎn)度值較高，提示該節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)（supplementary materials table S4）。在各中藥所含有效成分中，槲皮素展現(xiàn)出極高的連接度（度值=87），遠(yuǎn)超其他有效成分，而其余較高連接度值依次是木犀草素（度值=43）、山柰酚（度值=33）、黃芩素（度值=23）、丹參酮A（度值=20）、花生四烯酸（度值=20）、β-谷固醇（度值=18）。中藥是一個多有效成分的復(fù)雜系統(tǒng)，一個有效成分可作用于多個靶點(diǎn)，協(xié)同作用于某種疾病的治療。而在靶點(diǎn)的分析中，較高連接度的靶點(diǎn)可能在EM 的治療作用中起著重要的作用。前列腺素G/H 合酶2(PTGS2，度值=82）、前列腺素 G/H 合酶 1（PTGS1，度值=39）兩者擁有最高的度值，是臨床上炎性疾病治療的主要靶點(diǎn)；核受體輔活化子2（NCOA2，度值=35）、核受體輔活化子1（NCOA1，度值=34)緊跟其后，同樣在各炎癥通路中作用顯著；凝血酶(度值=31）是臨床上治療出血的重要靶點(diǎn)，直接作用于血液凝固過程的最后一環(huán)；Mu-type 阿片受體（OPRM1，度值=30）則涉及到中樞鎮(zhèn)痛功能。上述靶點(diǎn)均和EM 癥狀及病機(jī)之間有著密切的關(guān)系。

圖1 七味活血化瘀中藥 EM 相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)量及所占比例

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用STRING 軟件構(gòu)建靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)，圖中包含119 個節(jié)點(diǎn)，505 條邊，所有節(jié)點(diǎn)平均度值為8.49，具體見圖3。根據(jù)“度值＞均值”篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)56 個（supplementary materials table S6），前 9 位關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，平均度值為 88，見表 2，與PPI 網(wǎng)絡(luò)74%節(jié)點(diǎn)存在相互作用關(guān)系，提示它們在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，可能是活血化瘀藥物治療EM 的關(guān)鍵所在。

2.4 KEGG 通路分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫查詢每種中藥針對EM 的相關(guān)基因，獲得相關(guān)KEGG 通路信息。整理各中藥KEGG 通路相關(guān)基因富集情況，發(fā)現(xiàn)七味中藥共有信號通路44 條（supplementary materials table S5），篩選出與 EM 密切相關(guān)的 19 條通路（表 3）。從表3 中，不難發(fā)現(xiàn)，19 條通路涉及性激素、炎癥、細(xì)胞調(diào)亡以及血管生成等各個方面，其中炎癥相關(guān)通路達(dá)到7 條，為所有通路中最多。利用Prism 8.0 軟件繪制通路靶點(diǎn)富集熱圖，根據(jù)圖4 可知，在系列通路中，澤蘭與桃仁作用均弱于其他五味中藥。而在PI3K-Akt、IL-17、TNF 三條信號通路中，多味中藥靶點(diǎn)存在高度富集，紅花在PI3K-Akt 信號通路中顯著富集，遠(yuǎn)超該藥其他通路，值得注意。

3 討論

圖2 活血化瘀中藥主要成分?靶點(diǎn)圖

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中提取出了94 個符合標(biāo)準(zhǔn)的成分，通過VENE 圖去重以及分析網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)涮匦院?，發(fā)現(xiàn)槲皮素為四味活血化瘀藥所共有，與83 種EM 相關(guān)靶點(diǎn)存在關(guān)聯(lián)?，F(xiàn)代研究表明，槲皮素具有抑制炎癥、血小板聚集和血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，通過抗氧化作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可通過雌激素受體，調(diào)控受體下游多種底物及信號通路而調(diào)節(jié)雌激素[6-7]。木犀草素與41 種EM 靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，具有抗炎、抗纖維化、抑制血管生成等作用[8]。EM發(fā)生發(fā)展過程中慢性炎癥反應(yīng)一直貫穿始終，且存在纖維化病變，木犀草素或在EM 治療中有一定作用[9-10]。

圖3 119 個節(jié)點(diǎn) PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

表2 PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

通過VENE 圖，發(fā)現(xiàn)七味中藥共有作用靶點(diǎn)19 個，部分共有靶點(diǎn)與Cytoscape 網(wǎng)絡(luò)圖以及PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)高度對應(yīng)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了該部分共有靶點(diǎn)在EM 中的作用。如PTGS2，該靶點(diǎn)所調(diào)控環(huán)氧合酶（COX-2）的高表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞的高增殖性、高侵襲性，誘導(dǎo)血管生成從而加重EM 的疼痛和不孕癥狀[11]。NCOA2、NCOA1 的水平異常與EM 的進(jìn)展關(guān)聯(lián)密切。趨化因子參與子宮內(nèi)膜異位種植過程中趨化、黏附、侵襲、血管形成及細(xì)胞生長分化等多個重要環(huán)節(jié)[12]。Xiu 等發(fā)現(xiàn)，在分泌期，NCOA1 和趨化因子CXCL12 在異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜；活化血小板對異位內(nèi)膜具有促炎、促血管生成的作用，促使異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和增殖[13-14]，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞可分泌F2，以密集依賴的方式誘導(dǎo)血小板活化和聚集，從而影響EM 的進(jìn)展[15-16]。VEGFA 可促進(jìn)新生血管形成并使血管通透性增加，陳曉莉等[17]研究表明，內(nèi)異癥組血清和腹腔液VEGF 水平明顯高于對照組，且重度患者腹腔液中VEGF 水平高于輕度患者，VEGF 在EMT 患者血管生成中起促進(jìn)性作用,在血清與腹腔液中的高表達(dá)與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。尉偉東等[18]發(fā)現(xiàn)CASP3 蛋白在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中的評分明顯低于正常對照組，caspase-3 的水平下降提示內(nèi)膜細(xì)胞活性下降，促使子宮內(nèi)膜細(xì)胞自發(fā)性凋亡增加以及凋亡信號敏感性增強(qiáng)，誘導(dǎo)或加重EM。

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫，找到了七味活血化瘀藥共有EM 相關(guān)通路19 條，涉及性激素、炎癥、細(xì)胞凋亡以及血管生成等方面。所有通路中，炎癥通路達(dá)到36%。其中PI3K-Akt、IL-17、TNF 三條信號通路是靶點(diǎn)富集最多的通路，提示活血化瘀藥主要通過抗炎作用來對EM 起治療作用。與正常女性相比，EM 患者的子宮內(nèi)膜在位和異位內(nèi)膜細(xì)胞的PI3K 表達(dá)增加，AKT 磷酸化水平升高，證實(shí)PI3K/AKT 信號通路可影響 EM 進(jìn)展[19]。EM 是一種雌激素依賴性疾病，呈現(xiàn)出慢性炎癥反應(yīng)，多種炎性因子參與其病理過程，包括 NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-17 等[20]。許麗華等[21]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EM 患者血清及腹腔液中TNF-α 水平顯著高于對照組。EM患者Ⅲ和Ⅳ期血清和腹腔液中TNF-α 水平均高于Ⅰ和Ⅱ期，證實(shí)了TNF-α 與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),有助于子宮內(nèi)膜異位癥的診斷。IL-1 家族在EM 發(fā)生發(fā)展中作用顯著，與正常女性相比，EM 患者靜脈血中IL-1β 濃度顯著增高。不僅僅是 IL-1β，研究顯示，IL-1β 前體蛋白（proIL-1β）也可以加重炎癥反應(yīng)，EM 患者腹腔液中IL-1β、proIL-1β 水平均高于健康女性。IL-1 家族細(xì)胞因子的損傷，導(dǎo)致EM 患者腹腔免疫機(jī)制的紊亂，局部以及全身IL-1β、IL-18 調(diào)控機(jī)制的缺陷，使得內(nèi)膜組織的侵襲性以及生長性大幅增加，從而導(dǎo)致EM[22-24]。炎癥相關(guān)通路的高富集也與之前網(wǎng)絡(luò)圖中TNF、IL-6 等炎性相關(guān)靶點(diǎn)的高度值相對應(yīng)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了活血化瘀藥物通過抗炎作用治療EM 的作用機(jī)制。細(xì)胞凋亡是一種獨(dú)特的程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞的有效清除而不會引起炎癥反應(yīng)，EM 特征為異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率下降。與健康女性子宮內(nèi)膜相比，EM 異位內(nèi)膜抗凋亡因子表達(dá)增加，促凋亡因子表達(dá)減少，證實(shí)了細(xì)胞凋亡在EM 的發(fā)病中確有作用，并和炎癥反應(yīng)存在一定關(guān)聯(lián)[25]。EM 發(fā)生發(fā)展過程中亦伴隨著血管生成增多以及局部病灶周期性出血，EM 患者異位內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)量增高，抗血管生成因子(sFlt-1) 表達(dá)量下降，證實(shí)VEGF 信號通路、血小板激活通路均參與此過程，與前面靶點(diǎn)分析也形成呼應(yīng)[26-27]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是各種慢性疾病中慢性疼痛形成和維持的調(diào)節(jié)因子，EM 伴有疼痛的患者血清和腹膜液中神經(jīng)營養(yǎng)因子濃度明顯高于無疼痛EM 患者[28]。利用KEGG 通路分析，可以發(fā)現(xiàn)活血化瘀藥對于炎癥、凋亡、疼痛、血管生成等相關(guān)通路均具備調(diào)控作用，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了臨床上活血化瘀藥對于EM 的治療價值。

表3 七味活血化瘀中藥的 19 條 KEGG 通路

圖4 七味活血化瘀中藥 KEGG 信號通路熱圖

綜上所述，活血化瘀中藥可通過多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用方式對EM 進(jìn)行治療，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病特色。上述七味中藥中，桃仁、澤蘭對于EM 的作用低于其余活血化瘀藥，而紅花、益母草在EM 治療體系中，EM 相關(guān)靶點(diǎn)高于其余中藥，可能會起到更好的療效，在臨床上可嘗試推廣使用。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度出發(fā)，根據(jù)活血化瘀中藥有效成分和作用靶點(diǎn)，在一定程度上對活血化瘀中藥治療EM 進(jìn)行了機(jī)制的解析，為指導(dǎo)臨床用藥提供了一定的依據(jù)。但本研究僅僅基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫，利用計(jì)算機(jī)軟件從理論上對活血化瘀中藥治療EM 作用機(jī)制做了探析，還需要通過實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐來進(jìn)一步證實(shí)，而且還需要擴(kuò)大活血化瘀藥物探究范圍，結(jié)合臨床實(shí)際，深入剖析活血化瘀藥共同點(diǎn)與差異之處。