樣本溶血對血凝抑制試驗(yàn)和膠體金法檢測新城疫病毒抗體的影響

杭柏林,劉保國,吳世秀,鄧麗,陳文杰

（1.河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州225009）

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起多種禽類如雞、鴨、鵝、鴿、雉、鸚鵡、鵪鶉等的新城疫（Newcastle disease,ND）,是一種急性敗血型高度致死性傳染病,發(fā)病率和病死率可達(dá)100%[1-2].新城疫對世界各國養(yǎng)禽業(yè)的危害巨大,是一種烈性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的動物疫病[1].疫苗免疫接種是預(yù)防新城疫的有效方法.免疫后常常需要定期進(jìn)行免疫效果的監(jiān)測與分析.新城疫病毒免疫效果監(jiān)測有許多不同的方法,其中血凝抑制（HI）試驗(yàn)操作簡單,在基層得到了廣泛應(yīng)用.影響血凝抑制試驗(yàn)的因素有很多,如器材、試劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、紅細(xì)胞、血清等[2-3],其中血清樣本是一個重要的影響因素.血液樣本在制備成血清的過程中常常會出現(xiàn)溶血.樣本溶血對某些測試或檢測結(jié)果產(chǎn)生影響.高曉波等[4]報道,樣本溶血對HI 試驗(yàn)檢測禽流感病毒抗體有一定的影響.另外,膠體金法是一種檢測抗原和抗體的比較靈敏的方法,因簡單、快速的特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用.因此,本研究通過制備不同程度溶血樣本,觀察其對HI 法和膠體金法檢測新城疫病毒抗體的影響,希望為生產(chǎn)實(shí)踐提供一些建議和幫助.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯化鈉購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司,檸檬酸鈉購自天津市博迪化工有限公司,新城疫活疫苗（La Sota 株）購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司,新城疫病毒血凝抑制試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司,新城疫病毒抗體膠體金檢測卡購自北京中科越洋科技有限公司.

T2020B 電子天平,常熟市天量儀器有限責(zé)任公司；MJ-78A 高壓蒸汽滅菌器,上海施都凱儀器設(shè)備有限公司；TG16-WS 離心機(jī),BCD-325WKY1DPM冰箱,廣東海信容聲冰箱有限公司；HH-B11 培養(yǎng)箱上海醫(yī)療器械七廠.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 1%紅細(xì)胞懸液的制備 從新鄉(xiāng)市洪門鎮(zhèn)中心菜市場采集健康公雞（2.5 kg 左右）的血液,用3.8%檸檬酸鈉抗凝,然后按照文獻(xiàn)[5]的方法制備1%雞紅細(xì)胞懸液.

1.2.2 模擬不同程度溶血樣本 取3.8%檸檬酸鈉抗凝的新鮮雞血液1 mL,按照紅細(xì)胞懸液制備方法進(jìn)行紅細(xì)胞洗滌,洗滌后加滅菌生理鹽水至1 mL,凍融2 次,4 000 r/min 離心10 min,上層為無抗體的完全溶血液（A 液）.按照表1 中設(shè)定的量,加入滅菌生理鹽水和新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,混合后制備出不同溶血程度的樣本.

表1 模擬不同程度溶血樣本中所加試劑的量Tab.1 Amount of reagent added to different degrees of simulated hemolysis samples μL

1.2.3 臨床樣本的制備 從翅靜脈采集新城疫疫苗免疫鴿的血液,同一血液樣本分成兩份.一份血液于4 000 r/min 離心10 min,上清即為常規(guī)方法制備的血清.另一份血液置于-20 ℃約4 h,取出后,室溫下融化,而后再凍融1 次,然后于4 000 r/min 離心10 min,上清即為凍融方法制備的溶血血清.

1.2.4 血凝抑制試驗(yàn) 按文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行新城疫病毒的血凝抑制試驗(yàn).

1.2.5 膠體金法 按照新城疫病毒抗體膠體金檢測卡說明書進(jìn)行操作.

1.2.6 統(tǒng)計分析 利用GraphPad Prism 軟件中的統(tǒng)計分析工具Paired t test（one-tailed,Confidence Intervals為95%）對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測樣本的制備結(jié)果

用于HI 檢測和膠體金法檢測的樣本如圖1 所示.在不溶血的新城疫病毒抗體陽性血清溶液中加入不同量的人工制備的溶血液,隨著加入溶血液量的增加,樣本的顏色越來越深,結(jié)果如圖1-A 所示.通過常規(guī)方法制備的60 份血清樣本中,根據(jù)溶血程度區(qū)分,主要有4 種類型：不溶血樣本（圖1-Ba,清亮的黃色）有48 份,占比80%；微量溶血樣本（圖1-B-b）,相當(dāng)于模擬溶血樣本中溶血程度≤5%的樣本）有6份,占比10%；輕微量溶血樣本（圖1-B-c）,相當(dāng)于模擬溶血樣本中溶血程度在5%～10%的樣本）有4 份,占比6.67%；輕量溶血樣本（圖1-B-d）,相當(dāng)于模擬溶血樣本中溶血程度10%～15%的樣本）有2 份,占比3.33%.凍融制備的樣本顏色非常深,圖1-C 中,c 樣本顏色最深,a 樣本次之,b 樣本比a 和c 樣本稍淡,但所有凍融樣本顏色均比圖1-A 中50%溶血樣本深很多,表明凍融樣本的溶血程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于50%.

圖1 檢測樣本的制備結(jié)果Fig.1 Preparation results of test samples

2.2 HI 試驗(yàn)檢測結(jié)果

對模擬不同程度溶血樣本進(jìn)行新城疫病毒抗體血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測,結(jié)果如表2 所示.5%～45%溶血樣本的檢測結(jié)果與不溶血樣本（0%）檢測結(jié)果一致,但50%溶血樣本檢測結(jié)果降低了1 個HI 效價.

表2 模擬不同程度溶血樣本新城疫病毒抗體檢測結(jié)果Tab.2 Test results of NDV antibody in different degrees of simulated hemolysis samples

對60 份臨床鴿子樣本進(jìn)行新城疫病毒抗體血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測,結(jié)果如表3 所示.按常規(guī)方法制備的血清樣本中有4 份檢測結(jié)果≥11log2,在這4 份凍融樣本中,有3 份檢測結(jié)果一致,有1 份檢測結(jié)果降低.以常規(guī)方法制備的血清樣本檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),將凍融樣本檢測結(jié)果與之比較,檢測結(jié)果一致的樣本有23 份,占比38.33%,檢測結(jié)果上升的樣本有13 份,占比21.67%,檢測結(jié)果下降的樣本有24 份,占比40%.將常規(guī)方法和凍融法制備樣本檢測結(jié)果進(jìn)行t 檢驗(yàn)統(tǒng)計分析,如圖2 所示,結(jié)果凍融樣本的總體平均值顯著低于常規(guī)血清（P＝0.032,P＜0.05）.

表3 臨床樣本的HI 試驗(yàn)檢測結(jié)果Tab.3 Results of clinical samples with HI test log2

圖2 常規(guī)方法和凍融方法制備樣本HI 平均效價Fig.2 The average HI titer of samples prepared by conventional method and freeze method

2.3 樣本溶血對HI 檢測結(jié)果判定的影響

樣本溶血對檢測結(jié)果判定時的影響如圖3 所示.在對不溶血的黃色血清、常規(guī)制備時部分溶血樣本（非凍融的溶血樣本）和凍融溶血樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行判定時,僅極個別樣本第1 孔的結(jié)果不太清晰,而后續(xù)孔結(jié)果都能較好呈現(xiàn),除了凍融樣本的第2 孔結(jié)果可能稍微模糊,但仔細(xì)觀察仍能判定.

圖3 溶血樣本對HI 檢測結(jié)果判定的影響Fig.3 Effect of sample hemolysis on the determination of HI test results

2.4 膠體金法檢測結(jié)果

通過膠體金法對制備的不同溶血樣本進(jìn)行新城疫病毒抗體檢測,結(jié)果如圖4 所示.所檢測的樣本均在檢測卡上出現(xiàn)一條紅色的線,表明檢測樣本中存在新城疫病毒的抗體,且抗體效價≥5log2.模擬不同溶血程度樣本和不溶血鴿血清樣本檢測結(jié)果條帶非常清晰,判定時非常容易；雖然凍融樣本檢測結(jié)果條帶周圍顏色稍深,但仔細(xì)觀察仍能看到正確結(jié)果.

圖4 膠體金法檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of colloidal gold method

3 討論

溶血是臨床樣本檢測時常常遇到的問題,對臨床樣本檢測常常產(chǎn)生干擾[7-8].血液樣本在采集、運(yùn)送、分離和保存過程中因?yàn)閯×遗鲎?、溫度變化、滲透壓降低等理化因素的影響可能會導(dǎo)致細(xì)胞破裂,細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)入細(xì)胞外液,從而稀釋了細(xì)胞外液,細(xì)胞外液中抗體的量也即得到了稀釋[4,9-10].因此,在理論上,檢測結(jié)果會下降.在本研究中,模擬溶血樣本中高度溶血樣本檢測結(jié)果下降,臨床凍融溶血樣本抗體檢測結(jié)果下降的樣本量占比最高,在總體水平上也是下降的,基本上與理論預(yù)測結(jié)果相符合.在臨床凍融溶血樣本中,少部分樣本檢測結(jié)果上升了,這與高曉波等[4]的結(jié)果相一致.如何解釋這兩者之間的差異確實(shí)是個難題,還需要進(jìn)一步深入研究.

樣本溶血幾乎不影響HI 試驗(yàn)和膠體金法檢測新城疫病毒抗體結(jié)果的判定.溶血后,樣本顏色會有不同程度的加深.樣本顏色的加深可能會對HI 試驗(yàn)的第1～2 孔的判定稍有影響,但隨著稀釋度的增加,對后續(xù)孔的判定沒有任何影響.樣本顏色的加深對膠體金法結(jié)果的判定可能會有影響,高度溶血樣本的顏色非常深,會影響結(jié)果的判讀,可通過加大緩沖液的量使呈色物質(zhì)進(jìn)一步稀釋或展開,最終可得到準(zhǔn)確的結(jié)果.

4 結(jié)論

樣本溶血幾乎不影響HI 試驗(yàn)和膠體金法檢測新城疫病毒抗體結(jié)果的判定,但高度溶血會影響HI試驗(yàn)檢測新城疫病毒抗體的檢測結(jié)果,樣本制備時應(yīng)盡可能避免溶血.