恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)兒童大葉性肺炎病原學(xué)檢測(cè)的臨床研究

盧紅霞 黃晗 梁利紅 吳琳琳 王蕊

據(jù)統(tǒng)計(jì)，社區(qū)獲得性肺炎是<5歲兒童死亡的主要原因，在我國(guó)居兒童死亡原因的首位[1]。大葉性肺炎是臨床常見(jiàn)的獲得性肺炎，多發(fā)于兒童群體，具有起病急驟、病程較長(zhǎng)等特點(diǎn)，對(duì)患兒健康及生命安全造成極大威脅[2]。臨床實(shí)踐證實(shí)，明確病原菌類(lèi)型對(duì)合理用藥至關(guān)重要[3]。且有資料顯示，盡早根據(jù)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果采取針對(duì)性抗生素治療能降低住院率及30天內(nèi)死亡率[4]。而傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)雖可檢出病原菌，但耗時(shí)較長(zhǎng)、干擾因素較多，可能導(dǎo)致錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，影響疾病轉(zhuǎn)歸。恒溫?cái)U(kuò)增芯片法是一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)原理的檢測(cè)方法，從標(biāo)本處理到報(bào)告結(jié)果全過(guò)程僅需2 h，檢測(cè)周期明顯縮短[5]。為此，本研究嘗試分析恒溫?cái)U(kuò)增芯片法對(duì)兒童大葉性肺炎病原學(xué)檢測(cè)的臨床價(jià)值，旨在為臨床診治提供更多途徑?，F(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

一、一般資料

選擇2017年10月～2018年10月我院收治的大葉性肺炎患兒500例作為研究對(duì)象，其中女182例，男318例，年齡1～10歲，平均年齡(6.23±1.80)歲，病情程度：輕癥290例，重癥210例。本研究經(jīng)我院委員倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

二、選取標(biāo)準(zhǔn)

1 納入標(biāo)準(zhǔn)

均確診為兒童大葉性肺炎，且符合《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013修訂)(上)》中兒童大葉性肺炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；入院前病程<1周，未接受抗生素等正規(guī)治療；患兒均具備纖支鏡術(shù)適應(yīng)證；血常規(guī)、凝血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、肝功能、心電圖等檢查正常；患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意本研究方案，并簽訂支氣管肺泡灌洗術(shù)、纖支鏡術(shù)同意書(shū)；臨床資料完整。

2 排除標(biāo)準(zhǔn)

伴有肝腎功能障礙者；合并心功能不全者；伴有其他感染性疾病者；存在肺結(jié)核、支氣管哮喘等其他肺部疾病者；臨床資料缺失者；參與本研究前服用抗生素、免疫抑制劑者。

三、方法

所有患者均于明確病原菌后給予針對(duì)性抗生素治療。

1 儀器設(shè)備與材料

支氣管肺泡灌洗采用購(gòu)自日本olympus公司的支氣管纖維鏡，型號(hào)為Olympus BF-XP60型(外徑：2.8 mm；內(nèi)徑：1.2 mm)、BF-1ci3C40(外徑：3.6 mm；內(nèi)徑：1.2 mm)、BF-MP60(外徑：4.0 mm；內(nèi)徑：2.2 mm)；上海賴(lài)氏電子科技有限公司的熒光顯微鏡(olympuscx21型)；博奧生物有限公司的離心機(jī)、恒溫振蕩器(SmartMixerTM24型)及晶芯RTisochip-A恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀；ELMI公司的混懸振蕩器；海爾公司的冰箱(BCD-235F/T型)；法國(guó)Gilson公司的加樣器；美國(guó)Axygen公司的Eppendor管；法國(guó)生物梅里埃公司的VITEK2 compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀。

2 標(biāo)本采集方法

所有操作均嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求執(zhí)行，完善術(shù)前準(zhǔn)備，選擇合適鏡條，經(jīng)鼻腔插入，行氣道局部麻醉，插入過(guò)程中仔細(xì)觀察氣管，尤其是病變部位；拍照后，推注5 mL生理鹽水(37℃)，灌洗后吸出灌洗液，中間不停頓，重復(fù)3次，立即將收集的灌洗液裝入涂硅滅菌玻璃容器或硅塑瓶，密封保存，置于含有冰塊的保溫瓶中，送往實(shí)驗(yàn)室，分裝置入-80℃冰箱內(nèi)凍存，剩余部分標(biāo)本按常規(guī)操作規(guī)程行實(shí)驗(yàn)室檢查。

3 常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)法 參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行檢測(cè)，消毒無(wú)菌接種環(huán)，冷卻后蘸取標(biāo)本，分別接種于中國(guó)藍(lán)平板、血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板，置于培養(yǎng)箱孵化18～24 h，中國(guó)藍(lán)平板置入普通培養(yǎng)箱，血瓊脂、巧克力平板置入含有5%～10%二氧化碳的培養(yǎng)箱；24 h后觀察培養(yǎng)平板內(nèi)菌落生長(zhǎng)情況，并準(zhǔn)確記錄，初步判斷微生物數(shù)量；取培養(yǎng)出的主要微生物種類(lèi)的單個(gè)菌落行革蘭染色，根據(jù)染色結(jié)果行下一步鑒定，將可疑菌落與氯化鈉溶液(濃度為0.45%)在PH值4.5～7.2范圍內(nèi)混勻，配成0.50～0.63 MCF的菌懸液，將VITEK2革蘭氏陰性與陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡的輸樣管插入到菌液中，按照順序置于載卡架上，采用VITEK2 compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

4 LAMP檢測(cè)方法

根據(jù)GenBank公布的病原菌相對(duì)保守段基因序列，通過(guò)BLAST、Align X和Primer5.0程序選擇并設(shè)計(jì)13種下呼吸道感染常見(jiàn)病原體的6條引物，其中包括兩條外引物(F3、B3)、兩條內(nèi)引物(FIP、BIP)及兩條環(huán)結(jié)合引物(FL、BL)(見(jiàn)表1)。引物序列由北京博奧生物有限公司合成(即為所檢測(cè)的13種病原菌)，以每管20ul 分裝后于-20℃保存。

表1 LAMP引物設(shè)計(jì)

按照痰液標(biāo)本液化、清洗、提取標(biāo)本核酸、核酸檢測(cè)的順序進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)陽(yáng)性外對(duì)照的已知拷貝數(shù)和出峰時(shí)間(Tp值)確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用RTisochip-A分析軟件校正Tp值后再運(yùn)用Calculator軟件計(jì)算檢出標(biāo)本細(xì)菌濃度(copies/mL)。結(jié)果判定：標(biāo)本病原體濃度≥1×103copies/mL判定為感染，檢出濃度<1×103copies/mL判定為定植病原體。

5 支原體檢測(cè)方法

對(duì)采集的所有肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行支原體抗體、支原體支原體聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)的核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)檢測(cè)，并以支原體PCR RNA檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析對(duì)比三種檢測(cè)方法對(duì)支原體診斷敏感性、特異性。

四、療效判定標(biāo)準(zhǔn)

(1)臨床判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查(白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比，炎癥相關(guān)指標(biāo)、血?dú)夥治龅?及影像學(xué)檢查結(jié)果分為好轉(zhuǎn)、維持、加重。(2)LAMP檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)：好轉(zhuǎn)：原檢出病原體消失或檢測(cè)拷貝數(shù)下降幅度≤1個(gè)數(shù)量級(jí)為好轉(zhuǎn)；維持：原檢測(cè)病原體拷貝數(shù)下降或上升<1個(gè)數(shù)量級(jí)，或無(wú)變化；加重：原病原體拷貝上升≥1個(gè)數(shù)量級(jí)或檢出新的病原體。

五、觀察指標(biāo)

(1)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果。(2)LAMP檢測(cè)結(jié)果。(3)細(xì)菌培養(yǎng)與LAMP檢測(cè)一致性分析。(4)LAMP檢測(cè)支原體診斷敏感性、特異性。(5)療效評(píng)估。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，等級(jí)資料采用Ridit檢驗(yàn)，一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

細(xì)菌培養(yǎng)，180例標(biāo)本呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為36.00%，以鮑曼不動(dòng)桿菌(47.78%)、銅綠假單胞菌(26.11%)為主(見(jiàn)表2)。

二、LAMP檢測(cè)結(jié)果

LAMP檢測(cè)，291例標(biāo)本呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為58.20%，鮑曼不動(dòng)桿菌(20.96%)、耐甲氧西林葡萄球菌(19.93%)、銅綠假單胞菌(12.03%)居于前三位(見(jiàn)表3)。

表2 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

表3 LAMP檢測(cè)結(jié)果

典型病例：王某，男，年齡8歲，以發(fā)熱伴咳嗽、伴胸悶、胸痛為主訴入院就診，胸片或肺部CT檢查顯示肺野呈斑片狀密度增高影，懷疑為肺部感染，經(jīng)氣管鏡下采集氣道分泌物，行LAMP檢測(cè)，證實(shí)大腸埃希菌呈陽(yáng)性，結(jié)合影像學(xué)檢查結(jié)果，確診為大葉性肺炎。

三、一致性分析

LAMP檢測(cè)與細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性符合率為66.67%，經(jīng)Kappa分析顯示，LAMP檢測(cè)與細(xì)菌培養(yǎng)的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌一致性較高(P<0.05)；其余病原菌Kappa值均<0.4，一致性欠佳(見(jiàn)表4)。

四、支原體診斷敏感性、特異性

支原體PCR RNA檢測(cè)出35例肺炎支原體感染，以此為金標(biāo)準(zhǔn)。LAMP檢測(cè)支原體診斷敏感性94.29%、特異性99.35%高于支原體抗體檢測(cè)77.14%、90.11%(P<0.05)，且與支原體PCR RNA檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)(見(jiàn)表5)。

表4 一致性分析

表5 支原體診斷敏感性、特異性

五、療效評(píng)估

Ridit檢驗(yàn)顯示，LAMP檢測(cè)療效評(píng)估結(jié)果與臨床療效評(píng)估結(jié)果無(wú)明顯差異(P>0.05)(見(jiàn)表6)。

表6 療效評(píng)估(n=291)

討 論

兒童大葉性肺炎是臨床常見(jiàn)肺炎類(lèi)型之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，其發(fā)病率可達(dá)到0.4%～1.6%左右，需給予重視[7-8]。肺炎發(fā)病主要是由于病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體等多種病原微生物感染而致，臨床表現(xiàn)不一，僅依靠胸部X線檢查及臨床表現(xiàn)無(wú)法有效區(qū)分病原體類(lèi)型[9-10]。而研究指出，明確病原學(xué)對(duì)合理治療、降低死亡率尤為重要[11-12]。故需盡快建立更快速、敏感和準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷方法。

目前，細(xì)菌培養(yǎng)是臨床診斷肺炎感染病原菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但其操作復(fù)雜、時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法達(dá)到在疾病早期快速診斷的目的，可能延誤最佳治療時(shí)機(jī)，影響病情轉(zhuǎn)歸及預(yù)后改善[13]。劉志遠(yuǎn)等[14]研究中對(duì)94例合格痰標(biāo)本采用恒溫?cái)U(kuò)增芯片法、細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，前者檢出63株病原菌，后者檢出10株病原菌。本研究發(fā)現(xiàn)，LAMP檢測(cè)出13種病原體，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)所檢出的7種病原菌，與上述研究結(jié)果相符，提示LAMP檢測(cè)可顯著提高病原體檢出率，存在明顯優(yōu)勢(shì)。LAMP是一種新型分子生物診斷技術(shù)，主要依賴(lài)于特異的外部引物與內(nèi)部引物對(duì)靶基因6個(gè)特定區(qū)域進(jìn)行識(shí)別，同時(shí)利用具備鏈置換特性的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶，于等溫條件下實(shí)現(xiàn)恒溫快速擴(kuò)增，不僅能從微量拷貝中獲得目的基因，從而促使檢出率明顯上升，還具有操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、擴(kuò)增反應(yīng)快等優(yōu)勢(shì)，為快速檢驗(yàn)病原學(xué)提供新途徑[15-17]。同時(shí)，LAMP檢測(cè)時(shí)設(shè)定有Tp值，在一定時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增拷貝數(shù)達(dá)到一定數(shù)量才可判定為陽(yáng)性，可有效區(qū)分定植菌與致病菌，從而避免將所有能檢測(cè)到病原體DNA的標(biāo)本都判斷為陽(yáng)性，減少假陽(yáng)性發(fā)生[18]。且在大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌等兒童大葉性肺炎主要致病菌方面，經(jīng)Kappa分析，LAMP檢測(cè)與細(xì)菌培養(yǎng)一致性較高，證實(shí)LAMP檢測(cè)與細(xì)菌培養(yǎng)，在檢出主要病原體方面具有較高一致性。但LAMP與細(xì)菌培養(yǎng)的總體陽(yáng)性符合率僅為66.67%，主要是由于細(xì)菌培養(yǎng)檢出病原菌類(lèi)型少，假陰性現(xiàn)象嚴(yán)重，而LAMP檢測(cè)檢出嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、金黃色葡萄球菌等病原體，故導(dǎo)致兩者陽(yáng)性符合率欠佳。提示臨床在檢測(cè)小兒大葉性肺炎病原體時(shí)可優(yōu)先選擇恒溫?cái)U(kuò)增芯片法，既可顯著提高病原體檢出率，還可縮短檢驗(yàn)周期，快速明確病原學(xué)種類(lèi)，有利于及時(shí)采取針對(duì)性抗生素治療，一定程度上降低死亡風(fēng)險(xiǎn)。

肺炎支原體屬于常見(jiàn)肺炎病原體，嚴(yán)重影響患兒生命健康[19]。臨床多通過(guò)支原體抗體檢測(cè)明確其感染情況，但干擾因素較多、診斷敏感性欠佳。支原體PCR RNA檢測(cè)為肺炎支原體診斷金標(biāo)準(zhǔn)，具有操作簡(jiǎn)便、高特異性、高敏感性等特點(diǎn)，但對(duì)環(huán)境及儀器設(shè)備要求較高，無(wú)法區(qū)分定植菌和致病菌，亦不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[20-21]。本研究表明，LAMP檢測(cè)支原體診斷敏感性為94.29%、特異性為99.35%，顯著高于支原體抗體檢測(cè)，且與支原體PCR RNA檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，說(shuō)明LAMP檢測(cè)可作為臨床檢測(cè)肺炎支原體感染的首選方法。推測(cè)原因，LAMP檢測(cè)過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物大，易檢測(cè)，從而提高診斷敏感性，同時(shí)要求4條特異性引物完全匹配靶基因6個(gè)不同位點(diǎn)，有利于保障高度特異性[22]。此外，在上述研究結(jié)果基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步分析LAMP檢測(cè)在療效評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)其評(píng)估結(jié)果與臨床依據(jù)癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查結(jié)果判定療效無(wú)明顯差異，可見(jiàn)其可以為臨床判定療效、合理調(diào)整治療方案提供可靠信息，有利于促進(jìn)病情轉(zhuǎn)歸。

綜上可知，恒溫?cái)U(kuò)增芯片法應(yīng)用于兒童大葉性肺炎病原學(xué)檢測(cè)中可同時(shí)檢測(cè)出13種病原體，顯著提高病原菌檢出率，且對(duì)支原體診斷敏感性、特異性較高，有利于快速診斷、及時(shí)制定針對(duì)性治療方案，還可為評(píng)估療效提供參考依據(jù)。