雷帕霉素在 PIK3CA 相關的過度生長 ( PROS ) 的臨床應用進展

殷悅涵 孫麗穎 田文

作者單位：100035 北京積水潭醫(yī)院手外科、北京大學第四臨床醫(yī)學院

PIK3CA 相關的過度生長現(xiàn)象 ( PROS ) 是一類疾病的總稱，包括多種過度生長性的罕見病，從單個手指到整個肢體，甚至可以包括腹部和腦[1]。該類疾病常為先天性，無家族史，病程呈進展性。其病因為 PIK3CA 基因突變，活化下游的 AKT 及 mTOR 信號通路，促進組織細胞過度生長[2]。目前該病尚無藥物治療，通常需要手術治療，但術后復發(fā)率高，常需多次手術，為患者及其家庭帶來很大的負擔。雷帕霉素通過與 FKBP12 結合，抑制 mTOR 的功能，從而抑制該通路下游的一系列生理功能，發(fā)揮藥理作用[3]。此前研究表明雷帕霉素安全性較高[4]，可以應用于小兒，有可能用于 PROS 的藥物治療?，F(xiàn)就 PI3K-AKTmTOR 信號通路、PIK3CA 基因突變對該通路的影響、PROS 的發(fā)病機制及雷帕霉素的生物學作用及臨床應用等綜述如下。

一、PI3K-AKT-mTOR 通路

PI3K-AKT-mTOR 通路作為細胞內非常重要的信號轉導途徑——在細胞的生長、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學功能，該通路紊亂會引起一系列疾病，如癌癥、神經(jīng)病變、自身免疫性疾病和造血系統(tǒng)疾病等[5]。

PI3Ks 信號參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種功能的調節(jié)，其活性增加常與多種癌癥相關。PI3K的磷脂酰肌醇 PI 的肌醇環(huán)上有 5 個可被磷酸化的位點，多種激酶可磷酸化磷脂酰肌醇 ( PI ) 肌醇環(huán)上的第四、五位點，可使其一或兩者均發(fā)生磷酸化修飾[6]。通常 PI-4，5-二磷酸 ( 4，5-二磷酸磷脂酰肌醇，PIP2 ) 在磷脂酶 C 的作用下，產(chǎn)生二酰甘油和 1，4，5-三磷酸肌醇。PI3K 轉移一個磷酸基團至位點 3，形成的產(chǎn)物對細胞的功能具有重要的影響，如單磷酸化的 3-磷酸磷脂酰肌醇，能刺激細胞遷移，而未磷酸化的則不能。3，4-二磷酸磷脂酰肌醇則可促進細胞的增殖、抑制細胞凋亡，而其前體分子4-磷酸磷脂酰肌醇則不能[7]。PIP2 轉換為 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，可調節(jié)細胞的黏附、生長和存活。

PI3K 可分為 3 型，其結構與功能各異，I 型的底物主要為 PI、3-磷酸磷脂酰肌醇 ( PIP ) 級 PIP2；II 型的底物主要為 PI 及 PIP；III 型的底物主要為 PI。其中研究最廣泛的為 I 型，其為異源二聚體，由一個調節(jié)亞基 p85 和一個催化亞基 p110 ( 包括 p110α，β，δ，γ，而 δ 僅存在于白細胞中，其余則廣泛分布于各種細胞中 ) 組成[8]。PI3K通過兩種方式激活，其一是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構象改變而被激活；其二是通過 Ras 和 p110 直接結合導致 PI3K 的活化。PI3K 激活的結果是將 PIP2 催化成 3 位磷酸的第二信使 PIP3 ( 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇 )。PIP3 與細胞內含有 PH 結構域的信號蛋白 AKT 和 PDK1 結合，促使 PDK1磷酸化 AKT 蛋白的 Ser308 導致 AKT 的活化。AKT 則會進一步將信號傳遞至下游分子，如 mTORC1、GSK3 以及BCL-2 等來調節(jié)不同的細胞生理學過程，如細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等 ( 圖1、2 )[6,9]。

二、PIK3CA 基因突變對該通路的影響

PIK3CA 基因是屬于 PI3K-AKT-mTOR 信號通路中的一個關鍵原癌基因，位于 3 號染色體上，共有 20 個外顯子[10]。PIK3CA 突變約 80% 發(fā)生在螺旋區(qū) ( Helical ) 和激酶區(qū) ( Kinase ) 這兩個熱點區(qū)域，其中最常見的三個突變是外顯子 20 上的 H1047R，外顯子 9 上的 E542K 和 E545K。許多研究證實多種人類實體腫瘤中存在著 PIK3CA 突變。

PIK3CA 基因編碼的蛋白質是 IA 型 PI3Ks 的催化亞基，PIK3CA 突變后可導致激酶活性增強，繼而持續(xù)刺激下游 AKT，增加細胞侵襲和轉移能力，與結直腸癌、成膠質細胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌相關[6,11]。同時，隨著過度生長類疾病越來越受到重視，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn) PIK3CA基因突變在過度生長類疾病中起著至關重要的作用。

三、PIK3CA 突變與 PROS

PROS 指由 PIK3CA 基因突變引起的罕見的、非對稱性的過度生長。PIK3CA 基因編碼磷酸酰肌醇-3 激酶( PI3K ) 的 p110α 催化亞基，而 PI3K 能夠活化下游的 AKT及 mTOR 信號通路[2]，促進組織生長，引起多樣的非對稱性過度生長，包括：脂肪組織、肌肉、皮膚、骨、血管、淋巴管、神經(jīng)組織等[12-15]。最常見的是脂肪組織和血管的過度生長，反映了這些組織具有較強的可塑性和生長潛力。PROS 的并發(fā)癥取決于其解剖學位置和過度生長的范圍，包括：功能障礙 ( 如行走障礙、吞咽困難 )、疼痛、復發(fā)性淺表感染、血栓栓塞、出血，上述均影響人的健康，并可導致早期死亡。而現(xiàn)有的治療主要是縮容術、截肢、血管栓塞，治療效果并不理想，有較高的術后復發(fā)率及再手術率[16]。

已有研究發(fā)現(xiàn)一些基因型與表型的對應關系[6,17]，突變發(fā)生的時間和位點不同導致表型不同，這是導致 PROS患者間個體差異大的根本原因。此外，也有一些過度生長僅發(fā)生于兒童時期，還有一些在成年后逐漸發(fā)生，其原因尚不清楚。過度生長的組織與正常組織在影像學上往往缺乏明顯的分界，這些都增加了治療方法研究的難度。

PIK3CA 體細胞突變的表型在不同患者中既有相同點，又有不同點[2]，包括：巨腦及毛細血管畸形 ( megalencephaly-capillary malformation，MCAP / M-CM )[12]，纖維脂肪過度生長 ( fibroadipose hyperplasia or overgrowth，F(xiàn)AO )[13]，不對稱性多發(fā)性脂肪瘤病 ( hemihyperplasia with multiple lipomatosis ，HHML )[14]，先天性脂肪瘤性過度生長、血管畸形、表皮痣綜合征 ( Congenital Lipomatous Overgrowth，Vascular Malformations，and Epidermal，CLOVES syndrome )[11,15,18]，巨指癥 ( macrodactyly )，半側巨腦綜合征 ( hemimegalencephaly )[11,15,18]，偏身性肌肥大( macrodactyly and muscle hemihypertrophy )，面部滲透性脂肪增生 ( facial infiltrating lipomatosis )[20]，脂溢性角化病( seborrheic keratoses )[21]，良性苔蘚角化病 ( benign lichenoid keratoses )[22]，巨腦綜合征 ( megalencephaly syndromes ) 等 ( 圖3、4 )[10]。

四、雷帕霉素在該過程中的作用機制

圖1 PI3K-AKT-mTOR 信號通路示意圖： 促進； 抑制Fig.1 PI3K-AKT-mTOR signal pathway:enhance;inhibit

圖2 PI3K-AKT 通路的信號調控。這些因子的作用為調節(jié)細胞的生長、增殖、代謝及自噬；BAD：細胞凋亡的 BCL-2 抑制因子；GS：糖原合酶；GSK3：糖原合酶激酶 3；AS160：160kDa的 AKT 底物；FOXO：叉形頭轉錄因子 O 亞型；BIM：與 BCL-2相互作用的細胞凋亡誘導因子；TSC2：結節(jié)性硬化癥 2；RHEB：腦 RAS 同系物；eIF4E：真核細胞翻譯起始因子 4E；4EBP1：eIF4E 結合蛋白 1；rS6：核糖體 S6 蛋白；S6K：S6 激酶；eNOS：上皮一氧化氮合成酶Fig.2 The signal regulation of PI3K-AKT pathway. These cell factors regulates cell growth, proliferation, metabolism and autophagy.BAD: BCL-2 antagonist of cell death; GS: glycogen synthase; GSK3:GS kinase 3; AS160: AKT substrate of 160 kDa; FOXO: forkhead box O; BIM: BCL-2-interacting mediator of cell death; TSC2: tuberous sclerosis 2; RHEB: RAS homologue enriched in brain; eIF4E:eukaryotic translation-initiation factor 4E; 4EBP1: eIF4E-binding protein 1; rS6: ribosomal S6 protein; S6K: S6 kinase; eNOS: epithelial nitric oxide synthase

雷帕霉素通過與 FKBP12 結合，抑制 mTOR 的功能[23]，從而實現(xiàn)其免疫抑制作用 ( 圖5 )[3]。FKBP12-雷帕霉素復合物與 mTOR 相互作用，產(chǎn)生的 FKBP12-雷帕霉素-mTOR 復合物干擾 IL-2 受體與其它細胞因子、生長因子受體的通路[24-27]。因此，它抑制 T 細胞細胞周期中 G1期到 S 期的進展，從而抑制 T-細胞增殖 ( 圖5 )[28]。

五、雷帕霉素治療 PROS 的臨床試驗

雷帕霉素作為 mTOR 抑制劑，被批準應用于移植后的免疫抑制治療，它還可以減緩攜帶 PIK3CA 變異的癌細胞的生長[29]。雷帕霉素能夠有效地抑制 AKT 信號通路，并抑制 PROS 患者真皮纖維母細胞的增殖[29]，這提示雷帕霉素治療 PROS 有效。尚有一些未發(fā)表的研究提出了雷帕霉素對于 PROS 患者的超適應證應用[30]。為了進一步評估雷帕霉素治療 PROS 的效果，Parker 等[4]分別在英國、美國、法國的多個中心進行低劑量雷帕霉素治療 PIK3CA 突變的 PROS 的臨床研究，并定量評估疾病進程。

該研究為非隨機、開放性研究，前期進行 26 周的觀察以測量生長情況 ( 圖6 )。研究中，盡可能地對患側及健側進行受試者內部比較。由于人們已逐漸認可雷帕霉素在PROS 患者中的超適應證應用[31]，該研究未設置安慰劑對照組。該試驗共持續(xù) 52 周，第 0～26 周不使用藥物，稱為預處理期；第 26～52 周使用藥物，稱為治療期；受試者在第 0 周 ( 預處理期之前 )、第 26 周 ( 預處理期之后、治療期之前 )、第 52 周 ( 接受 26 周的治療之后 ) 進行雷帕霉素有效性的評估。

圖3 PI3K-AKT 通路及相關的過度生長疾病Fig.3 PI3K-AKT pathway and related overgrowth syndrome

圖4 PIK3CA 不同位點的突變與過度生長臨床表型的關系 [10]( *熱點突變；**強相關性；+中度相關性 )Fig.4 Different mutations of PIK3CA and related clinical overgrowth syndrome ( *Hot spot mutations; **Strong mutations; +Intermediate )

圖5 免疫抑制劑雷帕霉素、他克莫司、環(huán)孢素 A 的作用機制 [42]。雷帕霉素通過與其細胞內受體 FK506 結合蛋白 12 ( FKBP12 ) 結合，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 ( mTOR )。mTOR 分為兩個結構不同的催化亞基：mTOR 復合物 1 ( mTORC1 ) 和 mTOR復合物 2 ( mTORC2 )。mTORC1 對雷帕霉素敏感 ( 實線 )，而mTORC2 只有在長期暴露于雷帕霉素時才受其影響 ( 虛線 )。雷帕霉素與 mTORC1 結合，可阻止 T 細胞 G1 期向 S 期的細胞周期進展，從而抑制 T 細胞增殖。而他克莫司和環(huán)孢素分別與 FKBP和環(huán)卟啉結合，產(chǎn)生的復合物阻斷鈣調神經(jīng)素的作用，而鈣調神經(jīng)素是活化的 T 細胞核因子 ( NF-ATc ) 進行脫磷作用所必需的。上述過程導致 NF-ATc 向細胞核運轉的過程受到抑制，抑制白細胞介素-2 的基因轉錄Fig.5 The mechanism of rapamycin, tacrolimus and cyclosporin.Rapamycin inhibits mTOR by binding to FKBP12. There are two different catalytic subunits of mTOR: mTOR complex 1 ( mTORC1 )and mTOR complex 2 ( mTORC2 ). mTORC1 is sensitive to rapamycin ( solid line ) but mTORC2 is only affected when longterm exposure to rapamycin ( dotted line ). Rapamycin bounds to mTORC1 to inhibit the cell cycle from G1 phase to S phase of T cells.While tacrolimus and cyclosporin bound to FKBP and cyclophylin respectively, the production inhibits calcineurin which is required for dephosphrylation of the NF-ATc. The process mentioned above results in the inhibition of NF-ATc transfer to nucleus, and inhibits the transcription of IL-2

兒童及成人的雷帕霉素藥代動力學數(shù)據(jù)參考腎移植所用劑量的計算方法[32]。根據(jù)一項體外臨床預實驗的結果[33]，將雷帕霉素的目標血藥濃度定為 2～6 ng / ml，以使不良反應最小[34]。該研究中，所有受試者的平均雷帕霉素血藥濃度為 3.4 nm / ml，中位水平為 3.3 ng / ml。成人平均每日總劑量為 1.2 mg 膠囊口服 QD；兒童為 0.58 mg 口服溶液 BID。定期進行實驗室檢查包括：血細胞計數(shù)、腎功能、肝功能、快速血糖、血脂、尿液分析以檢測受試者的健康情況 ( 圖6a )。

研究人員通過對患側臨床觀察及健、患側對比來評估過度生長的情況。選擇無過度生長、無皮膚及血管異常的正常組織作為對照。正常組織與受累部位進行對比，優(yōu)先順序為：對側肢體 / 軀干、同側肢體 / 軀干、其它無明確受累的部位。非對稱性但廣泛受累的情況被認為沒有正常組織。對每位受試者在第 0、26、52 周進行雙能 X 線骨密度 ( DXA ) 掃描。DXA 圖像可實現(xiàn)局部和全身的可重復測量，包括骨、脂肪、肌肉，但無法評估血管和淋巴管畸形[21]。對于不能一次完成掃描的成年人 (n＝3 )，進行第二次掃描以涵蓋全身。該檢查能夠獲得軟組織密度和身體各節(jié)段 ( 左腿、右腿、左側軀干、右側軀干、左臂、右臂、頭 ) 的密度，脂肪為 0.9 g / ml，肌肉組織為 1.1 g / ml[35]?？偨M織容量包括脂肪組織和肌肉組織，不包括骨。同時，對每位受試者在 0、26、52 周進行 MRI 掃描以進一步評估。掃描區(qū)域的范圍是病變最近及最遠端的骨解剖標志位置，采用斜位平面掃描，掃描厚度為 5 mm，最多 100 片。掃描結果在分析前為盲法。計算體積時使用 SliceOmatic 軟件，可將理想的脂肪體積直觀地顯示出來 ( Dixon 序列 )，通過對不同梯度的計算以進行形態(tài)學區(qū)分。

圖6 該非隨機開放性實驗的流程圖 a：受試者評估入組 / 排除、分配的流程圖。在 39 名受試者中，30 名完成 26 周的雷帕霉素治療，30 名中的 23 名進行了解剖學療效評估。對所有受試者進行安全性和耐受性的評估；b：整體的研究流程。DXA / MRI =雙能射線吸收法 / 核磁共振Fig.6 The flow chart of the nonrandomized open-label study a: The inclusion / exclusion and allocation of the participants. 30 of the 39 enrolled participants completed 26 weeks of sirolimus therapy, and 23 of the 30 received therapeutic effect evaluation by anatomic method.All participants received safety and tolerability evaluation; b: The research procedure. DXA / MRI = dual energy X-ray absorptiometry /magnetic resonance imaging

Parker 等[4]的臨床試驗篩選 41 名受試者，39 名入組。其中 22 名兒童 ( ＜16 歲，最小者 3 歲 )，17 名成人( ≥ 16 歲，最大者 48 歲 ) ( 圖6b )；平均 16.6 歲；44% 為女性，56% 為男性。30 名完成 26 周的用藥，2 名在用藥23 周后因暫時停藥而沒有完成試驗，7 名因發(fā)生不良事件退出試驗，退出標準為：不良事件 ( AEs ) 等級 ≥ 3，包括中性粒細胞減少癥、蛋白尿 ( 定性檢測 3+ )、肝功能異常 ( ALT 高于正常上限 3 倍 )、腎功能異常 ( 腎小球濾過率GFR＜70 mls / min / 1.73 m2)、肺炎或肺功能下降；嚴重、復發(fā)的感染或敗血癥；QT 間期延長。完成 26 周試驗的30 名中，97% 的受試者接受 80% 以上的每日劑量。結果顯示，在雷帕霉素治療期間，受累組織的容積降低 7.2%( -7.2%，SD 16.0；P＝0.04 )，而未受累的組織沒有顯著增加 ( +1.7%，SD 11.5；P＝0.48 )。肌肉、結締組織和血管組織顯著減少 6.3% ( -6.3%，SD 13.3；P＝0.03 )，脂肪組織減少為 9.8% ( 9.8%，SD 24.4；P＝0.07 )。但這項研究也有一些局限性。盡管突變基因相同，但受試者的表型差異很大；且樣本量較小，故在評估雷帕霉素治療過度生長有效性方面仍需要繼續(xù)研究。

六、展望

PI3K-AKT-mTOR 通路作為細胞內非常重要的信號轉導途徑——在細胞的生長、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學功能，PIK3CA 基因編碼 PI3K 的催化亞基，而 PI3K 能夠活化下游的 AKT 及mTOR 信號通路，促進組織生長，引起多樣的非對稱性過度生長[36-39]。雷帕霉素作為腎移植的免疫抑制劑已被廣泛應用于臨床，已有大量研究就其藥代動力學、安全性及不良反應進行了闡述[40-41]，是一種較為安全的臨床用藥，此前曾用于多種疾病的治療。根據(jù)雷帕霉素的作用機制，其在治療 PROS 時的療效值得期待?，F(xiàn)國外已有相關臨床試驗初步驗證雷帕霉素治療 PROS 有效[42]，可以進一步開展相關臨床試驗，驗證其有效性及安全性，并細化其在小兒患者中的使用劑量，制訂相關用藥指南，為 PROS 的藥物治療提供新的思路。