乳制品及其相關(guān)食品中乳鐵蛋白常用檢測方法

□ 張君超 胡素麗 北京美正生物科技有限公司

隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們對食物營養(yǎng)的需求日益旺盛。乳鐵蛋白因具有抗菌、抗氧化、抗癌、促進(jìn)腸道發(fā)育、促進(jìn)鐵吸收，以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能，故在乳制品及相關(guān)的嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、特殊膳食食品、保健食品等生產(chǎn)中均有不同程度的添加。隨著“國家優(yōu)質(zhì)乳工程”的實施，眾多企業(yè)對巴氏殺菌乳工藝進(jìn)行改進(jìn)，從而保留了更多天然活性乳鐵蛋白。然而，我國尚未建立完善的乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白添加量與保留量的統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致生產(chǎn)者、監(jiān)管者和消費者無法在同一尺度上進(jìn)行衡量判別。本文通過對乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白現(xiàn)有的常用檢測方法進(jìn)行匯總，對不同檢測方法的適用樣本及檢測性能進(jìn)行分析，提出了不同乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白檢測方法的建議，旨在為乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白檢測的標(biāo)準(zhǔn)化提供思考與建議。

1 乳鐵蛋白的檢測需求

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是哺乳動物乳汁中存在的一種天然非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，具有強大的生物功能—抗菌、抗氧化、抗癌、促進(jìn)腸道發(fā)育和鐵吸收，以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等。因乳鐵蛋白具有優(yōu)質(zhì)生物功能，免疫力較低的人群、患有感染性疾病的人群、具有骨質(zhì)疏松風(fēng)險的人群，以及缺鐵性貧血人群均對于乳鐵蛋白的補充有所需求。

以嬰幼兒和兒童為例，現(xiàn)有的研究證據(jù)表明，牛乳鐵蛋白對嬰幼兒和兒童腹瀉、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、新生兒呼吸道疾病、新生兒敗血癥、兒童幽門螺旋桿菌感染等均有一定的預(yù)防和輔助治療作用，且對嬰幼兒貧血具有改善作用，并對嬰幼兒生長發(fā)育有促進(jìn)作用。

母乳是嬰幼兒獲得乳鐵蛋白的主要來源，而無法正常進(jìn)行母乳哺育的嬰幼兒和其他人群獲得乳鐵蛋白的主要來源則為其他乳制品及相關(guān)食品。因為牛乳鐵蛋白和人乳鐵蛋白的氨基酸序列同源性達(dá)69%，且具有相似的生物活性，所以是目前最易獲取的乳鐵蛋白來源之一。但鮮牛乳中的乳鐵蛋白含量僅為0.02～0.2g/L，約為母乳中的乳鐵蛋白含量（0.44～4.4g/L）的1/20，且鮮牛乳中的乳鐵蛋白會隨著加工過程中加熱時間、pH值、鐵飽和度及壓力等因素的變化而降低活性與功能。因此，大部分企業(yè)會在乳制品及相關(guān)食品中添加易獲得的牛乳鐵蛋白，其目前已被應(yīng)用于嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、特殊膳食食品及保健食品中。由于乳鐵蛋白原料價格較高，一些不法企業(yè)少添加或不添加乳鐵蛋白，使產(chǎn)品與宣傳標(biāo)示的添加量嚴(yán)重不符，侵犯了消費者的利益。牛乳鐵蛋白作為生鮮牛乳中的天然成分，更多地保留其天然營養(yǎng)活性也是目前關(guān)注的技術(shù)重點，“國家優(yōu)質(zhì)乳工程”明確提出優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳生物活性物質(zhì)的指標(biāo)要求—乳鐵蛋白≥25mg/L。如此看來，對乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白進(jìn)行檢測顯得尤為重要，其不僅能對標(biāo)示添加量進(jìn)行控制，還可對巴氏殺菌工藝進(jìn)行精準(zhǔn)控制。

2 乳鐵蛋白的常用檢測技術(shù)

目前，乳制品及相關(guān)食品中的牛乳鐵蛋白檢測尚無國家強制性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的常用檢測方法按照檢測原理可分為免疫學(xué)分析法（免疫擴散法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測法）和色譜分析法（高效液相色譜法、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法/超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、凝膠電泳檢測方法）。此外，分光光度法、離子共振法、生物傳感測定法、核酸適配體法等也有所報道。

2.1免疫學(xué)檢測

免疫學(xué)檢測是基于抗原抗體特異性反應(yīng)的檢測方法，已報道的乳鐵蛋白檢測方法有隨機免疫擴散法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測方法等。免疫學(xué)檢測的關(guān)鍵在于抗體的特異性，即乳鐵蛋白抗體與乳制品及相關(guān)食品中其他酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等成分無交叉反應(yīng)。

2.1.1 免疫擴散法

免疫擴散法以抗原-抗體的免疫沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)，以瓊脂為惰性載體，通過沉淀帶與乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度的關(guān)系即可定量測定待測樣品中乳鐵蛋白的含量。

免疫擴散法可用于檢測嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白的含量。該方法成本相對低廉，但操作步驟復(fù)雜，檢測耗時大于48h，且檢測結(jié)果需通過人為測量沉淀環(huán)直徑進(jìn)而容易產(chǎn)生誤差，檢測范圍在50～200mg/L之間，故在實際檢測中的應(yīng)用并不廣泛。

2.1.2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是在抗原與抗體特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上通過酶標(biāo)記及顯色劑判斷最終結(jié)果的常用檢測方法。乳鐵蛋白的分子量為70～80kD，因此常采用酶聯(lián)免疫雙抗夾心法進(jìn)行測定—在酶標(biāo)微孔上預(yù)包被牛乳鐵蛋白抗體，預(yù)包被的牛乳鐵蛋白抗體與酶標(biāo)抗體（酶標(biāo)物）同時與樣本中的牛乳鐵蛋白結(jié)合形成抗體-牛乳鐵蛋白-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)TMB底物顯色，樣本吸光值與牛乳鐵蛋白的含量呈正相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中牛乳鐵蛋白的含量。

由于抗原與抗體的特異性及酶催化效率，酶聯(lián)免疫方法具有反應(yīng)靈敏、特異性強的特點。據(jù)報道，對于乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白的檢測，乳粉檢出限可達(dá)20mg/kg，液體乳檢出限可達(dá)到0.1mg/kg。目前，酶聯(lián)免疫法商品化試劑盒的研發(fā)技術(shù)已相對成熟，故使檢測操作更為簡便，能夠?qū)Υ罅繕颖具M(jìn)行檢測，但不同廠家的試劑盒、實驗人員的操作經(jīng)驗和熟練程度等因素對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度有所影響。由于嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、特殊膳食食品、保健食品中相關(guān)乳制品中乳鐵蛋白的添加量較高，且不同廠家之間差異較大，因此檢測時需將樣本稀釋在試劑盒的線性范圍內(nèi)，使稀釋倍數(shù)提升2000～4000倍；同時，不同廠家之間的配方也有所不同，其他元素的干擾較多、樣本前處理方法不當(dāng)?shù)榷紩斐蓹z測結(jié)果的差異。為減少誤差，保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，對于同一樣本的檢測需要定期對試劑盒進(jìn)行質(zhì)控和回收試驗，建議每次對不同樣品進(jìn)行檢測時都要進(jìn)行隨行質(zhì)控或回收試驗。

2.1.3 免疫層析快速檢測

免疫層析快速檢測法的特點是在抗原與抗體特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上利用標(biāo)記技術(shù)和層析反應(yīng)，達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測待檢物的目的。對于簡單樣本液體乳而言，該方法不需要進(jìn)行前處理即可對大量樣本中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行快速篩查，具有簡便快速的優(yōu)點。乳鐵蛋白免疫層析快速檢測法的檢測限最低可達(dá)2.4μg/L，具有靈敏度高的特點，但該方法因存在樣本基質(zhì)差異問題和假陽性的風(fēng)險，不適用于其他成分復(fù)雜乳制品及相關(guān)食品的檢測，也不適用于執(zhí)法機構(gòu)進(jìn)行判別確證。因此，應(yīng)根據(jù)檢測特點選取合適檢測限的免疫層析快速檢測產(chǎn)品用于企業(yè)對巴氏殺菌工藝控制的快速判別。

2.2 色譜法檢測

色譜法檢測是利用不同的物質(zhì)在固定性和流動相兩相間的分配不同，從而達(dá)到待測物分離的目的。目前報道的乳鐵蛋白檢測方法有高效液相色譜法、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法/超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、凝膠電泳檢測方法等。

2.2.1 高效液相色譜法

高效液 相色 譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是利用不同的色譜柱對不同組分因分配系數(shù)及吸附力大小的不同而被分離，并被特定檢測器識別的定量檢測技術(shù)。HPLC方法因具有反應(yīng)靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點，在眾多乳鐵蛋白檢測方法中已被作為團體標(biāo)準(zhǔn)公布實施，同時也被作為食品中乳鐵蛋白測定的國家標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿中的第一法。此方法對于液態(tài)乳樣品的檢測定量限可達(dá)到5～20mg/kg，乳粉等固態(tài)樣品的定量限可達(dá)到10～100mg/kg。但因受復(fù)雜基質(zhì)所影響，HPLC方法在其他樣本檢測中的定量限不盡相同，如在特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的定量限能夠達(dá)到150mg/kg。HPLC方法的實際應(yīng)用并不廣泛，主要原因在于儀器昂貴、操作相對復(fù)雜、對實驗人員要求較高等。HPLC操作中復(fù)雜度較高的主要環(huán)節(jié)是樣品前處理，因其對樣品純度要求較高，且乳制品及相關(guān)食品的基質(zhì)成分相當(dāng)復(fù)雜，故無法直接進(jìn)行液相色譜檢測，目前常用肝素親和柱凈化乳制品及相關(guān)食品中乳鐵蛋白的檢測，而肝素親和柱的使用又增加了樣品的檢測成本。

2.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

質(zhì)譜儀通過測量特定離子的質(zhì)核比來對待測物進(jìn)行準(zhǔn)確定性，并能與高效液相色譜/超高效液相色譜等聯(lián)用來達(dá)到精確定量的目的。牛乳鐵蛋白的分子質(zhì)量為70～80kD，其檢測是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)與高效液相色譜-質(zhì)譜法/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合進(jìn)行，即先利用堿性胰蛋白酶水解牛乳鐵蛋白確定乳鐵蛋白的特異性肽段，并配合穩(wěn)定同位素肽段作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)而實現(xiàn)乳鐵蛋白定量檢測。該類方法抗干擾能力強、靈敏度極高、重復(fù)性好，其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的乳鐵蛋白定量限可達(dá)5mg/kg，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的乳鐵蛋白定量限可達(dá) 0.077～0.137mg/kg。 此 方 法 適用于多種樣本中牛乳鐵蛋白的含量測定，同時也能對其他來源的乳鐵蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。但這一方法的前處理過程需將乳鐵蛋白酶解，而活性與非活性乳鐵蛋白均可參與此過程，致使最終的檢測結(jié)果為樣本中乳鐵蛋白的總量，并不能區(qū)分樣本中活性乳鐵蛋白與非活性乳鐵蛋白。此外，該方法使用的設(shè)備相比HPLC更加昂貴，對操作人員的專業(yè)性要求也更高，因此適用性并不廣泛。

2.2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是以毛細(xì)管為分離通道、高壓直流電場為驅(qū)動力的液相分離技術(shù)，也是實驗室常用的分離與檢測蛋白質(zhì)的手段，該方法操作過程相對簡單，檢測乳鐵蛋白的定量限可達(dá)50mg/kg。但是，采用該方法易使乳鐵蛋白被毛細(xì)管壁吸附，導(dǎo)致檢測重復(fù)性差。通過體系優(yōu)化可以解決此問題，但不適用于乳鐵蛋白含量較低的樣本檢測，僅適用于添加乳鐵蛋白含量較多的食品檢測。

2.2.4 凝膠電泳檢測法

凝膠電泳檢測法是利用不同的DNA探針在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率不同，從而對目標(biāo)物進(jìn)行分離檢測的方法。在乳鐵蛋白檢測領(lǐng)域，選擇一種DNA探針分子與乳鐵蛋白特異性結(jié)合，根據(jù)DNA-乳鐵蛋白結(jié)合物在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率與條帶的灰度值便可對樣本中乳鐵蛋白進(jìn)行定量檢測。此方法使樣本中的乳鐵蛋白在高溫條件下與DNA探針進(jìn)行特異性結(jié)合，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，奶粉檢出限可達(dá)74mg/kg，生乳等的檢出限可達(dá)10mg/L，且無需借助色譜/質(zhì)譜/光譜等大型儀器，成本低、通量高，但操作相對繁瑣。

3 小結(jié)

綜上所述，不同檢測方法有著各自的優(yōu)缺點，監(jiān)管者、生產(chǎn)者可根據(jù)樣本類型及檢驗需求選擇合適的檢驗方法，但仍迫切需要建立統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)，讓不同檢驗方法擁有統(tǒng)一的對比標(biāo)準(zhǔn)。