改善卵母細胞體外成熟結(jié)局的研究進展

包云 柴娟（通訊作者） 盧俏俏 師帥 鄭群 鄒立波（金華市人民醫(yī)院生殖中心 浙江 金華 321000）

輔助生殖技術(shù)的出現(xiàn)和應用為治療不孕癥提供了新的途徑。常規(guī)的體外受精-胚胎移植通過控制性卵巢刺激技術(shù)使相當數(shù)量的卵泡同時發(fā)育，獲得較多的成熟卵母細胞及胚胎數(shù)量[1]。然而，在患有多囊卵巢綜合征或具有卵巢高反應性的不孕女性中應用超促排卵易導致卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生，不僅影響卵子的質(zhì)量，降低臨床妊娠率，更有危及患者生命的風險[2-4]。

未成熟卵母細胞的體外成熟（in vitro maturation， IVM）技術(shù)是從未經(jīng)促排藥物或低劑量藥物刺激的卵巢中，通過穿刺手術(shù)將未成熟的卵母細胞取出，在體外模擬卵泡內(nèi)環(huán)境促使卵子發(fā)育成熟并具有受精能力的一項技術(shù)。卵母細胞成熟的標志是減數(shù)分裂的啟動和完成，這是一個動態(tài)的過程，包括細胞核成熟和細胞質(zhì)成熟。胞核成熟包括生發(fā)泡破裂，核膜崩解，同源染色體分離，第一極體排出到卵周間隙。胞質(zhì)成熟是指細胞的蛋白合成模式改變，蛋白合成后的修飾，細胞質(zhì)中細胞器的重新排列。只有核質(zhì)同步成熟的卵母細胞才具備良好的受精能力和胚胎發(fā)育潛能。

IVM 技術(shù)目前主要應用于治療多囊卵巢綜合征患者、促性腺激素刺激高反應患者、卵巢低反應患者、卵巢早衰和腫瘤患者的生育能力保留等，該技術(shù)自1991 年在一名卵巢早衰的婦女體內(nèi)試驗成功后，至今全世界已經(jīng)有上千名健康嬰兒出生[5]。然而，通過IVM 技術(shù)培養(yǎng)的卵母細胞仍然存在成熟率偏低的問題，各種文獻報道大約在40%～70%之間，且成功受精的比例也不高，后期的胚胎發(fā)育潛能差，這些都是導致IVM 技術(shù)較常規(guī)體外受精-胚胎移植技術(shù)成功妊娠率偏低的重要原因。目前亟待解決的難題是如何為未成熟卵母細胞提供與卵泡內(nèi)微環(huán)境相似的培養(yǎng)系統(tǒng)，促使細胞核和細胞質(zhì)的成熟盡可能同步化。本文就目前國內(nèi)外在改善IVM 結(jié)局上的研究進展做一綜述。

1.顆粒細胞共培養(yǎng)在IVM 中的作用

在卵泡發(fā)育過程中，顆粒細胞包裹在卵母細胞周圍，通過細胞間的縫隙連接與卵母細胞進行雙向信息傳遞，實時調(diào)控卵母細胞的生長發(fā)育。根據(jù)顆粒細胞分布位置的差異，分為壁層顆粒細胞和卵丘顆粒細胞。其中壁層顆粒細胞廣泛存在于卵泡液中，研究者從體外獲卵后的卵泡液中分離得到壁層顆粒細胞，然后將收集的未成熟的卵母細胞與其共培養(yǎng)，選取發(fā)育成熟的卵母細胞進行卵胞漿內(nèi)單精子注射，結(jié)果顯示與對照組相比，共培養(yǎng)組的卵子成熟率，受精率，卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率更高[6]。卵丘顆粒細胞緊密包裹著透明帶，惠董娜等[7]在體視顯微鏡下通過機械分割的方式獲得卵丘顆粒細胞，并添加在IVM培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)卵子成熟率，受精率和優(yōu)胚率有所提高，后期的的囊胚形成數(shù)也更多。由此可見，顆粒細胞共培養(yǎng)可以提高卵母細胞的體外成熟率，改善胚胎發(fā)育的結(jié)局。卵母細胞體外成熟的過程會影響細胞的基因表達譜，包括參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，蛋白修飾和細胞周期的眾多基因。顆粒細胞共培養(yǎng)在一定程度上模擬了卵巢內(nèi)的生態(tài)環(huán)境，也可以減少基因突變的發(fā)生[8]。

2.生殖激素在IVM 中的作用

促性腺激素參與了卵泡的整個發(fā)育過程，卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）在竇前卵泡、竇卵泡和排卵前卵泡的發(fā)育和成熟的啟動和調(diào)控發(fā)揮重要作用。Javed A 等[9]在小鼠卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)液中加入FSH，發(fā)現(xiàn)卵泡的直徑相比于對照組有所增加，且卵泡存活率，卵母細胞成熟率和生發(fā)泡破裂的發(fā)生率都顯著提高。電鏡觀察表明，未成熟卵母細胞在添加FSH 的IVM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)36 小時后，其滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、皮質(zhì)顆粒等細胞器的數(shù)量增多，細胞器逐步向皮質(zhì)區(qū)遷移，核仁發(fā)生致密化。72 小時后，細胞表面的微絨毛形態(tài)變得細長且豎起，皮質(zhì)顆粒呈線性排列，線粒體均勻分布在皮質(zhì)區(qū)中央，這些都是成熟卵母細胞具備的特征。Arroyo A 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LH 可以降低排卵前的卵泡環(huán)狀核苷酸水平，從而使卵母細胞從第一次減數(shù)分裂停滯中釋放出來。在培養(yǎng)液中加入LH，與LH 受體結(jié)合后通過CNP/NPR2 系統(tǒng)和EGF/EGF 受體網(wǎng)絡降低環(huán)狀核苷酸水平，從而激活了成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF），活化的MPF 進一步誘導同源染色體分離，完成第一次減數(shù)分裂。

3.抗氧化劑在IVM 中的作用

未成熟卵母細胞自身代謝及體外培養(yǎng)操作過程中產(chǎn)生過多的活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）導致的氧化應激會導致卵母細胞成熟阻滯、染色體分離異常、基因表達異常、細胞骨架改變及細胞凋亡等，從而影響未成熟卵核和胞質(zhì)的成熟，降低后續(xù)形成胚胎的發(fā)育潛能。在IVM 培養(yǎng)液中添加抗氧化劑來平衡過多的ROS，提高細胞的抗氧化水平是目前體外抗氧化應激的主要方式[11,12]。藏紅花素是天然的抗氧化劑，Mokhber[13]等的研究結(jié)果顯示適宜濃度的藏紅花素及藏紅花水提取物可以增加IVM培養(yǎng)基中谷胱甘肽的濃度，改善卵母細胞細胞核的成熟率，提高胚胎的發(fā)育潛能。褪黑素是由松果體分泌的可以調(diào)節(jié)情緒、睡眠、生殖及晝夜規(guī)律的內(nèi)源性激素，是一種高效自由基清除劑，具有抗氧化的能力。卵泡液中就存在一定濃度的褪黑素，減輕卵母細胞在發(fā)育過程中收到的氧化應激損傷。有研究表明在IVM培養(yǎng)液中添加低濃度的褪黑素可以提高卵母細胞的成熟率，受精率，胚胎卵裂率，囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚率[14]。

4.能量物質(zhì)在IVM 中的作用

在卵母細胞的整個發(fā)育過程中，葡萄糖和丙酮酸作為能量來源發(fā)揮重要功能。GV 期的卵母細胞主要通過消耗葡萄糖維持自身的代謝需求，生發(fā)泡破裂后，對丙酮酸的利用率開始上升。在培養(yǎng)液中加入一定濃度的葡萄糖和丙酮酸，培養(yǎng)48 小時，通過時差成像動態(tài)觀察系統(tǒng)統(tǒng)計第一極體排出的時間，發(fā)現(xiàn)添加組的第一極體排出時間更短，獲得的成熟卵母細胞的數(shù)量更多。

5.展望

卵母細胞體外成熟技術(shù)的應用雖然在不斷的研究中取得了很大的進展，但受體外培養(yǎng)體系，IVM 胚胎發(fā)育潛能低及所獲胚胎的安全性的影響，目前在臨床上的應用相對局限。但隨著生殖醫(yī)學的發(fā)展，研究者們的不懈努力，卵母細胞體外成熟技術(shù)會越來越完善，造福更多的患者。