HPLC法定量測(cè)定青橄欖中沒食子酸含量

馮 娟，李秋平，黃思睿，張清杰，覃 亮

(1 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520；2 肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶 526061；3茂名市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 茂名 525000；4 廣州正一實(shí)驗(yàn)裝備有限公司，廣東 廣州 510095)

青橄欖，別稱黃欖、青果、山欖，為干燥成熟果實(shí)[1]。主要有檀香、自來圓、長(zhǎng)城、惠圓、普通級(jí)等品種，以藥用檀香種最好，藥用保健價(jià)值高，其對(duì)治療慢性咽炎，聲音嘶啞，喉嚨干腫及異物感，扁桃體炎，咳嗽等癥狀，有較好的效果[2-3]。青橄欖收載于《中藥志》，現(xiàn)代藥理研究表明，青橄欖在抗菌[4-5]、保肝[6-7]、抗腫瘤[8]等均表現(xiàn)出較好的活性。通過文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚未有人對(duì)青橄欖中沒食子酸的含量進(jìn)行分析報(bào)道。本試驗(yàn)中采用高效液相色譜法對(duì)青橄欖的成分沒食子酸的含量進(jìn)行了研究，旨在建立專屬性較強(qiáng)的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LC-2012CHT高效液相色譜儀，日本島津；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)，常州澳華儀器有限公司；MS205DU電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 試 劑

沒食子酸對(duì)照品，購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；青橄欖購于大參林連鎖醫(yī)藥公司；甲醇，默克股份，色譜純；其他試劑均為分析純，所用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定沒食子酸對(duì)照品15.92 mg，至50 mL的容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，搖均勻，然后精量1 mL溶液于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得(每一毫升中含0.0127 mg沒食子酸對(duì)照品)。

2.2 供試品溶液的制備

將青橄欖用粉碎機(jī)打粉，取青橄欖細(xì)粉約7.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 4 mol/L HCl溶液，稱定其重量，加熱回流4 h，放冷后，用4 mol/L HCl溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，精密量取續(xù)濾液2 mL于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液[9-10]定容至刻度。精量2 mL溶液到5 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的有機(jī)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

選用Inertsil ODS-3(5 μm)色譜柱，以0.1%磷酸溶液-甲醇(91:9)做流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，測(cè)定波長(zhǎng)219 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性的考察

吸取青橄欖供試品溶液、沒食子酸對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，在色譜條件下測(cè)定，經(jīng)驗(yàn)證，樣品溶液色譜圖中未見其他組分和輔料對(duì)測(cè)定組分沒食子酸的干擾。

圖1 沒食子酸色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系的考察

精密稱量沒食子酸對(duì)照品0.01529 g至50 mL的容量瓶中，加50%甲醇溶液溶解，并用其定容至刻度，搖均勻，分別精量1、2、3 mL至25 mL容量瓶中；1、3、5 mL至50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，搖均勻，即得6個(gè)濃度(0.006368 mg/mL、0.012736 mg/mL、0.019104 mg/mL、0.025472 mg/mL、0.031840 mg/mL、0.038208 mg/mL)的對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣10 μL，注入色譜儀中，按本實(shí)驗(yàn)擬訂的色譜條件測(cè)定。以沒食子酸對(duì)照品測(cè)得的峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程：y=77820235x+6255，r=0.9999884(n=6)。結(jié)果表明，沒食子酸的進(jìn)樣量在0.03194～1.14624 mg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，符合外標(biāo)法定量測(cè)定的要求。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一濃度(0.012736 mg/mL)的對(duì)照品溶液，在本實(shí)驗(yàn)擬定的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)沒食子酸的峰面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD%為0.27%(n=6)，顯示有良好精密度(結(jié)果見表1)。

表1 精密度試驗(yàn)

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品溶液，制備后，按含量測(cè)定方法吸取10 μL待測(cè)溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h注入色譜儀一次，測(cè)定其峰面積值，共測(cè)試6次[11]。結(jié)果含量的RSD%為0.2%(n=6)，表明在12個(gè)小時(shí)內(nèi)供試品溶液中沒食子酸的含量能基本維持穩(wěn)定(見表2)。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一個(gè)批號(hào)的6份供試品[12]，在相同的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明沒食子酸的平均含量是3.336 mg/g，RSD%為0.27%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，不超過規(guī)定范圍RSD%=3%，說明明重復(fù)性良好(見表3)。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.4.6 加樣回收實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證所建立的方法對(duì)供試品含量測(cè)定是否有影響，對(duì)相同濃度的同一批供試品進(jìn)行6次的回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，測(cè)得沒食子酸的平均回收率為99%，RSD%=0.38%，所測(cè)得結(jié)果不超過規(guī)定的平均回收率85%～120%范圍，表明該方法可行(見表4)。

2.4.7 樣品含量測(cè)定

取三批不同產(chǎn)地的青橄欖制備的供試品溶液，按設(shè)定的色譜條件，進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果說明該法穩(wěn)定性較高(見表5)。

表5 樣品含量測(cè)定

3 結(jié) 論

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，確立了青橄欖中沒食子酸的含量測(cè)定的方法。本實(shí)驗(yàn)方法采用Inertsil ODS-3(5 μm)為色譜柱，0.1%磷酸-甲醇(91:9)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為219 nm測(cè)定青橄欖中沒食子酸的含量，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、精密度好，可應(yīng)用于青橄欖中沒食子酸含量的測(cè)定。