遲珺曦,雷文平,2,劉孝芳,劉成國(guó),2*
1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙, 410128)2(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙, 410128)
益生發(fā)酵酸乳由于具備調(diào)節(jié)人體腸道菌群、緩解乳糖不耐癥、降膽固醇以及延緩衰老等功效[1]而深受消費(fèi)者青睞。一般情況下,嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌株是酸奶發(fā)酵常用的主要菌種。發(fā)酵的過(guò)程中也可以添加雙歧桿菌、乳酸鏈球菌、干酪乳桿菌等[2]菌種。由于對(duì)干酪乳桿菌的研究不斷加強(qiáng),人們也發(fā)現(xiàn)了其對(duì)人體健康的有益功效。比如對(duì)人體的免疫調(diào)節(jié),在食品行業(yè)形成了重要地位。由于干酪乳桿菌具有耐酸、耐膽鹽能力強(qiáng)的特點(diǎn),也常常單獨(dú)用于食品發(fā)酵中,其中發(fā)酵類乳制品較多[3]。如DIMITRELLOU等[4]在蘋(píng)果片和酪蛋白中添加凍干固定化干酪乳桿菌,將其接種到酸奶中發(fā)酵,這種新型的功能性酸奶產(chǎn)品在保藏的過(guò)程中保持了干酪乳桿菌的活力,酸奶的香氣和風(fēng)味也得到了明顯的改善。又如,胡風(fēng)林發(fā)現(xiàn)用青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵劑以2∶1接種,即可得到富硒酸奶[5]。
多數(shù)實(shí)驗(yàn)用混合益生菌株來(lái)發(fā)酵酸乳,而用單一益生性干酪菌株發(fā)酵的較少。所以本研究采用已證明的具有益生特性的單一干酪乳桿菌,根據(jù)其耐熱、耐鹽性、最適溫度、產(chǎn)酸能力、產(chǎn)黏能力、后熟情況、最終所需求的發(fā)酵乳的特性等來(lái)確定選擇標(biāo)準(zhǔn)[6]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)從湖南南山牧場(chǎng)牛奶中分離的,經(jīng)以往的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為益生菌的1株干酪乳桿菌LC-7進(jìn)行了研究,以確定其生物活性。且對(duì)該菌株的長(zhǎng)期發(fā)酵特性進(jìn)行了研究,得出了該菌株在功能性乳品開(kāi)發(fā)中的重要結(jié)論,為開(kāi)發(fā)功能性乳制品提供了科學(xué)依據(jù)。
干酪乳桿菌 (Lactobacilluscasei) LC-7,為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選保藏,經(jīng)以往的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,具有益生特性。MRS肉湯固(液)體培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛乳培養(yǎng)基(配制方法為:將20 g的脫脂乳粉溶于80 g去離子水中,于115 ℃條件下高溫滅菌20 min,滅菌后置于34 ℃條件下保存3 d,確認(rèn)無(wú)菌后使用);脫脂奶粉,澳優(yōu)-澳優(yōu)乳業(yè)(中國(guó))有限公司。
GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱,韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司;SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái),蘇州凈化有限公司;BKQ-B7511壓力蒸汽滅菌器,山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;FB224、NDJ-8S型黏度計(jì),上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;pH計(jì),上海般特儀器有限公司;UV-1600PC型分光光度計(jì)、GCMS-QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀,島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。
1.3.1 干酪乳桿菌的活化
在已滅菌好的MRS液體培養(yǎng)基中接種干酪乳桿菌種子液,于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h并活化2次。
1.3.2 菌株的生長(zhǎng)特性
1.3.2.1 干酪乳桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將2%活化好的干酪乳桿菌接種于60 mL的MRS液體培養(yǎng)基中,試管分為5組,每組12支,分別間隔0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24 h,并分別于32、34、37、40、42 ℃下培養(yǎng),培養(yǎng)過(guò)程中按編號(hào)上的對(duì)應(yīng)時(shí)間將試管取出,使用紫外分光光度計(jì)測(cè)出的OD600nm值繪制生長(zhǎng)曲線。
1.3.2.2 菌株耐鹽性測(cè)定
將活化的對(duì)數(shù)相菌液按2%的接種量(每組3個(gè))接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%~7% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm值,評(píng)價(jià)菌株的耐鹽特性[7]。
在800 g去離子水中加入200 g的脫脂乳粉,高溫滅菌20 min,溫度設(shè)定115 ℃,滅菌后于34 ℃條件下保存2 d,確認(rèn)無(wú)菌后分裝到試管內(nèi),按2%的接種量將LC-7菌液接種到裝有20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛乳的試管中,混勻后于34 ℃條件下培養(yǎng)。
按照1.4制備發(fā)酵乳,分別在0、8、14、20、24 h取樣測(cè)定其 pH值、滴定酸度、黏度、活菌數(shù)、穩(wěn)定性等指標(biāo)(每組做3個(gè)平行),發(fā)酵后的乳樣在4 ℃冰箱中保存24 h,分別在放置0、8、14、18、20、24 h測(cè)定上述指標(biāo)。
1.6.1 測(cè)定酸乳pH值
利用pH計(jì)測(cè)定酸乳在不同發(fā)酵時(shí)間、貯藏時(shí)間下的pH值,并繪圖。
1.6.2 測(cè)定酸乳滴定酸度
參照GB/T 12456—2008測(cè)定酸乳在不同的發(fā)酵時(shí)間、貯藏時(shí)間下的滴定酸度,并繪圖。
1.6.3 測(cè)定酸乳黏度
利用 NDJ-8S 型數(shù)顯黏度計(jì)測(cè)定酸乳在不同的發(fā)酵時(shí)間、貯藏時(shí)間下的黏度,并繪圖(參數(shù)為1~2×106mPa·s)。
1.6.4 測(cè)定酸乳活菌數(shù)
將酸乳樣品利用無(wú)菌生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl)稀釋得到7個(gè)梯度(10-1~10-7),并對(duì)后3~4個(gè)梯度進(jìn)行活菌數(shù)的測(cè)定,每個(gè)梯度平行3次。
1.6.5 測(cè)定酸乳穩(wěn)定性
參考劉素純等[8]關(guān)于測(cè)定酸乳離心沉淀率的方法來(lái)判斷酸乳的穩(wěn)定性。酸乳通過(guò)3 min的離心操作(8 000 r/min)后,移除上清液,酸乳的穩(wěn)定性即為沉淀物質(zhì)量與樣品質(zhì)量的比值如公式(1)所示:
(1)
1.6.6 測(cè)定酸乳蛋白水解酶活性
將1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的脫脂奶粉加入平板計(jì)數(shù)瓊脂中,在7 ℃條件下培養(yǎng)10 d后,進(jìn)而在37 ℃下孵育48 h,形成透明成暈的菌落的蛋白水解酶活性記為陽(yáng)性。
1.6.7 干酪乳桿菌LC-7發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析
參照雷文平等[9]測(cè)定發(fā)酵椰奶風(fēng)味物質(zhì)的方法以氣質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分。將已滅菌好的脫脂乳分成等量的2份,一份加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的普通酸奶發(fā)酵劑,另一份加入1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的普通酸奶發(fā)酵劑和1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的干酪乳桿菌LC-7混合發(fā)酵。24 h后取出,分別放入氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分。
樣品預(yù)處理:在15 mL萃取瓶?jī)?nèi)稱取1 g發(fā)酵好的酸乳樣品,將提取瓶的蓋子擰緊,并在50 ℃下處理30 min。老化后,萃取頭在70 ℃下吸附45 min。然后用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口解吸1 min。
氣相色譜條件:DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);入口溫度為250 ℃;柱箱升溫程序:初始溫度35 ℃、3 min, 3 ℃/min升溫至200 ℃,20 ℃/min升溫至250 ℃,保持5 min。載氣為氦氣,流速為1 mL/min。通過(guò)分流比10∶1的自動(dòng)注射分流進(jìn)行。
MS條件:電磁電離源,離子源溫度250 ℃;界面溫度200 ℃;檢測(cè)電壓1 kV,質(zhì)量掃描范圍m/z為35~400。
繪制L.caseiLC-7 的生長(zhǎng)曲線,橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間,縱坐標(biāo)為發(fā)酵液OD600nm值。結(jié)果如圖1所示,在42 ℃條件下,菌株生長(zhǎng)規(guī)律不明顯,在32、34、37、40 ℃時(shí)菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似,菌體濃度0~3 h生長(zhǎng)遲緩,此時(shí)菌株進(jìn)入生長(zhǎng)的延滯期,此時(shí)菌株處于進(jìn)入新環(huán)境后的適應(yīng)階段;菌體濃度在3~20 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,進(jìn)行快速生長(zhǎng)繁殖;菌液濃度在20~24 h進(jìn)入穩(wěn)定期,并緩慢上升,培養(yǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累達(dá)到最高峰,24 h后菌液濃度保持穩(wěn)定,即將進(jìn)入衰亡期。在這4組溫度間,菌株在34 ℃的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于其他4組。在生長(zhǎng)速度最快的8 h,發(fā)酵液的OD600nm值分別為0.476(34 ℃)、0.451(37 ℃)、0.373(42 ℃);在24 h菌株達(dá)到穩(wěn)定期間,發(fā)酵液的OD600nm值為0.802(32 ℃)、0.813(34 ℃)、0.713(37 ℃)、40 ℃和42 ℃的OD600nm值還不到0.500。34 ℃時(shí),菌株生長(zhǎng)速度相對(duì)于比其他溫度快,34 ℃細(xì)菌生長(zhǎng)延滯期短、指數(shù)期較快,穩(wěn)定后的菌液濃度也高于其他溫度。因此,可以確定該株菌的最適生長(zhǎng)溫度為34 ℃。
圖1 不同溫度下L. casei LC-7 發(fā)酵液OD600nm值的變化Fig.1 Changes of OD600nm value of L. casei LC-7 fermentation broth at different temperatures
較高的鹽濃度會(huì)使微生物的滲透壓升高,水分活度降低,結(jié)果微生物的血漿壁分離死亡,因此益生菌的主要特征之一是耐鹽性。由圖2可知,菌株對(duì)鹽濃度較為敏感。NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)<3%時(shí),對(duì)L.caseiLC-7 的生長(zhǎng)影響可以忽略不記,當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7%時(shí),LC-7的生長(zhǎng)速度受到很大影響。
圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl對(duì)干酪乳桿菌LC-7生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on the growth of L. casei LC-7
2.3.1L.caseiLC-7 酸奶在發(fā)酵以及貯藏過(guò)程中pH值的變化
發(fā)酵過(guò)程中,菌體代謝將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸,使牛乳變酸,pH值下降,同時(shí)與牛乳中的凝乳酶的共同作用,使牛奶凝固,并產(chǎn)生特定的風(fēng)味,也可防止雜菌污染[10]。如圖3所示,對(duì)脫脂乳中發(fā)酵的干酪乳桿菌LC-7的酸度變化進(jìn)行了測(cè)定。在發(fā)酵過(guò)程中pH值緩慢下降,14 h時(shí)肉眼可見(jiàn)酸乳逐漸變?yōu)榘牍腆w,開(kāi)始凝乳轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔?4 h時(shí)pH值達(dá)到了4.67。而酸乳在貯存期間pH值變化幅度較小,基本趨于穩(wěn)定。因此,干酪乳桿菌LC-7具有良好的乳品發(fā)酵性能。
圖3 L. casei LC-7 pH值隨發(fā)酵時(shí)間與貯藏時(shí)間的變化Fig.3 L. casei LC-7 pH value changes with fermentation time and storage time
2.3.2L.caseiLC-7 酸奶在發(fā)酵以及貯藏過(guò)程中滴定酸度的變化
菌體發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果控制著滴定酸度的變化。測(cè)定干酪乳桿菌LC-7在脫脂乳中發(fā)酵的酸度,以此評(píng)價(jià)菌種產(chǎn)酸作用強(qiáng)度。圖4顯示了隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)滴定酸度逐漸升高,滴定的酸度為40.4 °T。滴定酸度變化不明顯是在酸乳貯藏期間,一般保持在80~110 °T。由此可以確定其發(fā)酵酸乳具備產(chǎn)酸能力。
圖4 L. casei LC-7滴定酸度隨發(fā)酵時(shí)間與貯藏時(shí)間的變化Fig.4 Changes of L.casei titrated acidity with fermentation time and storage time
2.3.3L.caseiLC-7 酸奶在發(fā)酵以及貯藏過(guò)程中黏度的變化
黏度是評(píng)價(jià)酸奶口感及質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一,若控制不好,會(huì)產(chǎn)生乳清析出,或出現(xiàn)豆腐樣結(jié)構(gòu),影響其商業(yè)價(jià)值和食品安全[11]。由圖5可知,發(fā)酵開(kāi)始時(shí)0~14 h發(fā)酵乳黏度變化較慢,增長(zhǎng)幅度較小。14 h時(shí)開(kāi)始發(fā)酵乳黏度增加;在20 h之后,發(fā)酵乳黏度增長(zhǎng)迅速。這時(shí)發(fā)酵結(jié)束的酸奶中蛋白酶繼續(xù)發(fā)揮作用,催化底物蛋白水解,改變酸奶中微小蛋白質(zhì)亞膠體分子團(tuán)的狀態(tài),使得他們之間的親合作用減弱,進(jìn)而引起酸奶膠體的剛性降低和膠體分子團(tuán)聚集成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)松散的結(jié)果[12],在酸乳貯藏時(shí)期,前期隨著時(shí)間延長(zhǎng),酸奶的黏度總體呈先上升,后期略微下降的趨勢(shì),攪拌和均質(zhì)酸奶結(jié)構(gòu)遭到破壞,可能導(dǎo)致酸奶在貯藏期間黏度不穩(wěn)定,有部分乳清析出。
圖5 L. casei LC-7黏度隨發(fā)酵時(shí)間與貯藏時(shí)間的變化Fig.5 The L.casei viscosity changes with fermentation time and storage time
2.3.4L.caseiLC-7 酸奶在發(fā)酵以及貯藏過(guò)程中活菌數(shù)的變化
圖6為發(fā)酵過(guò)程中活菌的變化。前期活菌變化較小,發(fā)酵14 h后活菌變化增大。干酪乳桿菌LC-7的活菌數(shù)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中呈上升趨勢(shì),且呈正相關(guān)。發(fā)酵后,活菌總數(shù)達(dá)到6.2×107CFU/g。貯藏前期活菌數(shù)下降趨勢(shì)不明顯,后期下降趨勢(shì)明顯增加。24 d后的活菌數(shù)為4.3×107CFU/g。
圖6 L. casei LC-7活菌數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間與貯藏時(shí)間的變化Fig.6 The number of L.casei viable bacteria changes with fermentation time and storage period
2.3.5L.caseiLC-7 酸乳在發(fā)酵以及貯藏過(guò)程中的穩(wěn)定性
由圖7可知,發(fā)酵酸乳的穩(wěn)定性在0~14 h呈緩慢上升趨勢(shì),且穩(wěn)定性較高,14 h過(guò)后,酸奶開(kāi)始凝乳,在發(fā)酵中后期,酸乳穩(wěn)定性急劇下降,但在貯藏階段,酸乳的穩(wěn)定性基本保持在55%~65%。這是由于酸奶在發(fā)酵期間酸度升高,而在貯藏期間酸度逐漸降低, 當(dāng)達(dá)到酪蛋白的等電點(diǎn)時(shí),酪蛋白膠粒會(huì)聚集沉降[13],這兩方面會(huì)引起酸乳中微小蛋白質(zhì)的膠體分子團(tuán)發(fā)生變化,使它們之間的親合作用減弱,使酸乳膠體的剛性降低和膠體分子團(tuán)聚集成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)松散,導(dǎo)致酸乳的穩(wěn)定性下降[14]。
圖7 L. casei LC-7酸乳穩(wěn)定性隨發(fā)酵時(shí)間與貯藏時(shí)間的變化Fig.7 The stability of yoghurt L.casei changed with fermentation time and storage time
2.3.6L.caseiLC-7 酸乳在發(fā)酵以及貯藏過(guò)程中的蛋白水解酶活性
因?yàn)榈鞍踪|(zhì)被乳酸菌利用的能力差異較大,由于細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活性不同,所以有的蛋白質(zhì)被分解,還有一些只能利用胨、肽和氨基酸。在酸奶加工中,蛋白質(zhì)水解酶發(fā)揮重要作用。包括乳蛋白酶能釋放不同的肽和游離氨基酸,進(jìn)而影響酸奶的物理結(jié)構(gòu),同時(shí)會(huì)釋放功能肽,影響酸奶的風(fēng)味[15]。
由表1可知,發(fā)酵酸乳在0~18 h均未出現(xiàn)透明圈,蛋白水解酶活性為陰性,20 h以后,在脫脂牛乳平板上出現(xiàn)透明圈,24 h透明圈較為明顯。蛋白水解酶活性為陽(yáng)性。干酪乳桿菌LC-7具有水解蛋白的能力,但其水解活力較弱,再利用其發(fā)酵性質(zhì)時(shí)較為緩慢,但對(duì)于其風(fēng)味的產(chǎn)生有益。
表1 L. casei LC-7發(fā)酵酸乳蛋白水解酶活性檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of proteolytic enzyme activity in L. casei LC-7 fermentation yoghurt
2.3.7L.caseiLC-7酸乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析
風(fēng)味物質(zhì)中主要成分包括非揮發(fā)性酸、揮發(fā)性酸、羰基化合物及揮發(fā)性酯類等。而發(fā)酵乳風(fēng)味的主要來(lái)源離不開(kāi)其中的揮發(fā)酸和羰基化合物。產(chǎn)品的優(yōu)良性質(zhì)與這些風(fēng)味物質(zhì)的含量有著密切關(guān)系[16]。由表2可知,干酪乳桿菌LC-7發(fā)酵酸乳的風(fēng)味物質(zhì)占比較大,其中含有6種醇類、6種酸類、6種酯類、1種酚類和2種酮類物質(zhì)。
酸類物質(zhì)決定發(fā)酵酸乳的滋味,對(duì)比普通發(fā)酵酸乳與混合發(fā)酵酸乳中酸物質(zhì)的相對(duì)含量,發(fā)現(xiàn)車葉草苷酸和3-丁炔酸只在混合發(fā)酵酸乳中檢測(cè)到;苯甲酸與乙烯基癸酸在二者中均存在且相對(duì)含量較高,可見(jiàn)以上4類物質(zhì)是影響發(fā)酵酸乳的重要風(fēng)味成分。
酮類物質(zhì)存在于混合發(fā)酵酸乳中,是酸乳中的重要風(fēng)味物質(zhì)之一。其中2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮和3-甲基-3-吡唑啉-5-酮的相對(duì)含量分別為為1.08%和0.186%。酮類揮發(fā)性化合物一般呈奶油味或果香味[17],相比于普通發(fā)酵酸乳,其風(fēng)味更加醇和。
酯類物質(zhì)也是酸乳中重要的風(fēng)味物質(zhì),普通發(fā)酵酸乳和混合發(fā)酵酸乳酯類含量都比較高,棕櫚酸乙烯酯、十八酸乙烯酯和甘油三酯在混合發(fā)酵乳中的相對(duì)含量最高,分別達(dá)到19.364%、32.835%和35.975%,但相比于普通發(fā)酵酸乳,酯類含量明顯降低,減少了酸乳的油膩感,使酸乳的口感更加清淡綿柔。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出,普通發(fā)酵劑發(fā)酵出的酸乳風(fēng)味成分較為單一,相比于普通酸奶而言,干酪乳桿菌LC-7的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)更豐富,尤其是在酸類和酮類物質(zhì)中較為明顯。且比普通酸乳多了酸味和果香味,使酸乳的口味更佳。
作為益生菌之一的干酪乳桿菌,不僅對(duì)人體無(wú)任何毒害作用,而且還可以對(duì)其宿主營(yíng)養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效[12]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)現(xiàn)有保藏的1株經(jīng)驗(yàn)證后具有潛在益生特性的干酪乳桿菌LC-7的最適生長(zhǎng)條件和發(fā)酵特性進(jìn)行研究,綜上實(shí)驗(yàn)可以得出,干酪乳桿菌LC-7的最適生長(zhǎng)溫度為34 ℃,且在人體一定鹽濃度環(huán)境下可以存活,具備較好的耐鹽性能;34 ℃條件下24 h基本進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。其發(fā)酵性能良好,14 h基本凝乳,發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH值為4.67,滴定酸度為86.6 °T,黏度基本維持在189 mPa·s。4 ℃貯藏時(shí)其穩(wěn)定性基本保持在55%~65%。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)優(yōu)于普通發(fā)酵酸乳??傊? 本試驗(yàn)為干酪乳桿菌在今后開(kāi)發(fā)利用上提供了重要理論研究,但對(duì)于其確切的功能性質(zhì)以及制作乳制品發(fā)酵劑還需要?jiǎng)游锬P蛯?shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證,后續(xù)工作仍有待考究。
表2 不同樣品揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components of different samples