利用菊糖生產(chǎn)L-乳酸的菌株篩選鑒定和發(fā)酵工藝優(yōu)化

黃玉龍，孫若詩，全婷，劉燕，慕鈺文，康三江，張輝元*

1(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州，730070) 2(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州，730070)

菊芋(HelianthustuberosusL.)，從17世紀(jì)由歐洲傳入中國，又稱為洋姜、鬼子姜，菊科向日葵屬，為多年生宿根性草本植物。菊芋生長高度在1～3 m不等，秋季開花，花如菊，黃色。葉子橢圓形，多毛。根莖系統(tǒng)深埋于地下并且比較結(jié)實(shí)粗壯，葉子互生于莖的頂端，中央是花頭，多瘤的塊莖在地下不均勻生長，其顏色有淺褐色、白色、紅色等[1]。目前，國內(nèi)已有對(duì)菊芋莖葉中活性成分、藥理機(jī)制的相關(guān)報(bào)道[2]，大多關(guān)于菊芋的研究以菊糖的提取、酶解工藝為主[3-4]。菊芋作為一種潛在的生物資源，其酶解產(chǎn)物可作為生物基化合物如乙醇、丁醇、丁酸、2,3-丁二醇、檸檬酸、乳酸等的生產(chǎn)原料[5-6]。國內(nèi)外對(duì)L-乳酸的需求日趨增加，我國人多地少，糧食資源匱乏，進(jìn)行以廉價(jià)非糧原料生產(chǎn)L-乳酸的研究顯得尤為重要[7-8]。本文通過MRS改良培養(yǎng)基篩選產(chǎn)乳酸含量高的菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及基因序列分析法鑒定[9]，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)乳酸發(fā)酵基質(zhì)和培養(yǎng)條件進(jìn)行系統(tǒng)研究，得出以菊糖酶解液發(fā)酵L-乳酸的最優(yōu)工藝條件，旨在為菊芋的高值化開發(fā)提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮菊芋，購于甘肅蘭州，紅皮，肉質(zhì)塊莖。

菊糖酶解液：按液料比18∶1(mL∶g)于86 ℃下提取41 min的熱水浸提工藝制取菊芋汁，水提液過濾后得菊糖汁；在菊糖汁中添加酵母膏氮源1.0%(體積分?jǐn)?shù))，NaCl 0.5%(體積分?jǐn)?shù))，K2HPO40.3%(體積分?jǐn)?shù))，菊糖汁定容，初始pH6，經(jīng)黑曲霉(Aspergillusniger) A-15在30 ℃下?lián)u瓶發(fā)酵6 d，即為菊糖酶解液。菊芋汁中還原糖質(zhì)量濃度從酶解前的0.997 g/L提高到酶解后的24.22 g/L。

菌種來源：本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種，編號(hào)依次為G、A2、A4、zh。

蛋白胨，上海中泰；牛肉浸膏，北京雙旋；酵母膏，北京奧博星；檸檬酸氫二銨，天津凱通；K2HPO4，天津市北辰方工試劑廠；MnSO4、成都化學(xué)試劑廠；MgSO4、CH3COONa，中國醫(yī)藥公司；Tween-80、TE緩沖液、Marker、ddH2O等，革蘭氏染色成套試劑，北京索萊寶。其他試劑均為市售分析純或生物試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR) System，GeneAmp；SBA-40D生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；PHS-3C精密pH計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司；WZZ-2B自動(dòng)旋光儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀,紫外檢測器,DIONEX。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為MRS肉湯培養(yǎng)基。

溶鈣圈培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入2%的CaCO3，1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉，pH值自然。1×105Pa滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：依實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入各成分，菊糖酶解液定容，調(diào)pH值。1×105Pa滅菌15 min。250 mL錐形瓶搖瓶厭氧發(fā)酵，裝量50 mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌株的初篩

將本實(shí)驗(yàn)室保藏的4株產(chǎn)乳酸菌株，接入到MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以30 g/L果糖代替葡萄糖作為單一碳源進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，36 ℃，發(fā)酵96 h后測定發(fā)酵液中乳酸產(chǎn)量，選擇將果糖轉(zhuǎn)化為乳酸產(chǎn)率較高的菌株，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.4.2 菌株的鑒定

參考文獻(xiàn)[10-11]方法，根據(jù)篩選試驗(yàn)所選菌株，通過菌落形態(tài)觀察和基因序列分析對(duì)菌株進(jìn)行分類鑒定[12-13]。

(1)待鑒定菌株P(guān)CR的DNA模板的制備(反復(fù)凍融法)：100 ℃煮沸5 min，-20 ℃下冷凍5 min，循環(huán)2次；上述樣品5 000 r/min條件下離心1 min，吸取8 μL上清液即為PCR擴(kuò)增的DNA模板。

(2)待鑒定菌株16S rDNA的擴(kuò)增:以提取的DNA為模板，使用細(xì)菌16S rDNA通用引物P1(1 492r)、P2(27F)進(jìn)行擴(kuò)增。

反應(yīng)體系總體積50 μL：模板5 μL、Primer 1[1 μL(1 μmol/L)]、Primer 2[1 μL(1 μmol/L)]、Taq酶25 μL、ddH2O 18 μL；PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、58 ℃退火1 min、72 ℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃ 保存。

(3)瓊脂糖凝膠電泳，點(diǎn)樣量3 μL。

1.4.3 乳酸含量的測定

發(fā)酵液離心后取上清液，蒸餾水適當(dāng)稀釋，采用SBA-40D型生物傳感自動(dòng)分析儀測定乳酸含量[14-15]。

1.4.4 產(chǎn)乳酸條件優(yōu)化

利用微生物產(chǎn)乳酸的過程通常為厭氧發(fā)酵，影響乳酸產(chǎn)量較顯著的因素有K2HPO4、MnSO4、CH3COONa、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH值和氮源種類等[16-17]。以乳酸產(chǎn)量為考察指標(biāo)，對(duì)上述因素分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并選取影響較顯著的因素，采用4因素3水平正交試驗(yàn)，探究其對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中乳酸產(chǎn)量的影響水平。

1.4.5 乳酸的粗制及旋光度的測定

成熟的乳酸發(fā)酵液，煮沸后用石灰乳調(diào)pH值為9.5～10，攪拌后55 ℃靜置4 h，沉降菌體等懸浮物；趁熱過濾得乳酸鈣溶液，減壓濃縮至25%，用50%(體積分?jǐn)?shù))的H2SO4在80 ℃條件下酸解乳酸鈣，中和完全后，靜置1～2 h；減壓抽濾除去CaSO4得粗乳酸[18]。

粗制乳酸旋光度的測定：測定溫度為20 ℃，測定管長度為10 cm，乳酸質(zhì)量濃度7.5 g/L，在589.44 nm鈉單色光源下，測定樣品的旋光度[19]。

1.4.6L-乳酸和D-乳酸的測定

采用高效液相色譜法測定，色譜柱為Silversit C18，250 mm×4.6 mm×5 μm，流速0.5 mL/min，紫外檢測波長210 nm，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相為V(水)∶V(乙腈)=99.5∶0.5，柱溫30 ℃。

樣品預(yù)處理：取適量發(fā)酵液于50 mL離心管中，在4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，以除去CaCO3和菌體，取離心后的上清液，再加入等體積0.5 mol/L的H2SO4水溶液進(jìn)行酸解，離心除去CaSO4，取1 mL上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，再以0.45 μm的濾膜過濾即得待測液。乳酸標(biāo)樣在上述色譜條件下經(jīng)高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可利用果糖的乳酸菌株的篩選

將4株產(chǎn)乳酸菌株以果糖為單一碳源，MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h測定發(fā)酵液的乳酸產(chǎn)量并計(jì)算果糖轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如表1所示，編號(hào)為zh的菌株在4株菌中乳酸產(chǎn)量較高(41 mg/100mL)，且在此過程中果糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到68.3%。因此選取zh菌株進(jìn)行菌種鑒定和產(chǎn)乳酸條件優(yōu)化。

表1 不同菌株對(duì)果糖的利用率Table 1 Utilization of fructose by different strains

2.2 菌株zh的鑒定及產(chǎn)乳酸條件優(yōu)化

2.2.1 菌株zh的鑒定

通過菌落形態(tài)觀察(圖1-a)菌株zh在平板培養(yǎng)基上，菌落邊緣呈不規(guī)則雪花狀，中等大小，中間略有微小球狀突起，微黃色，邊緣濕潤，乳白色，直徑為(10±3) mm，菌落背面為乳黃色，實(shí)心菌落且生長旺盛。

對(duì)培養(yǎng)3 d的種子菌株zh進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢結(jié)果圖1-b所示，顯示為紫色桿狀，革蘭氏染色呈陽性，故其為G+。

溶鈣圈實(shí)驗(yàn)：在溶鈣圈固體培養(yǎng)基中接入菌株zh，36 ℃培養(yǎng)5 d后，結(jié)果如圖1-c所示，在菌落周圍有明顯的透明圈，判定菌株zh可能為乳酸菌。

a-菌落形態(tài);b-革蘭氏染色;c-溶鈣圈圖1 菌株zh鑒定Fig.1 Strain zh identification

過氧化氫酶反應(yīng)：反應(yīng)無氣泡產(chǎn)生，結(jié)果呈陰性。

糖發(fā)酵試驗(yàn)：反應(yīng)結(jié)果如表2所示，菌株zh可發(fā)酵的糖類有乳糖苷、纖維二糖、山梨醇、葡萄糖和果糖。

綜合菌株zh上述生理生化鑒定結(jié)果，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第9版，初步判定菌株zh為植物乳桿菌 (Lactobacillusplantarum)。

表2 菌株zh糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of stain zh

分子鑒定：菌株zh的PCR擴(kuò)增后電泳圖如圖2，對(duì)照用Marker條帶范圍是100～5 000 bp，菌株zh的條帶在1 300 bp左右。

圖2 菌株zh的PCR電泳圖Fig.2 PCR electrophoregram of zh

同樣的將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托華大基因(北京)測序后，得到序列在GenBank中登錄號(hào)為KY368099。將菌株zh的序列結(jié)果輸入到NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示此序列與L.plantarum菌株相似性較高。在NCBI上下載與所測序列有較高相似度(在96%以上)的序列，繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，菌株zh與L.plantarum在同一分支上，相似度>99%，最終確定菌株zh為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

圖3 菌株zh系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the strain zh based on 16S rDNA sequences

2.2.2 菌株zh產(chǎn)乳酸條件優(yōu)化結(jié)果與分析

在微生物生長代謝過程中，碳源、氮源、無機(jī)鹽、培養(yǎng)時(shí)間、溫度等外界因素均對(duì)代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生較大的影響[20]。碳源和氮源為必需營養(yǎng)物質(zhì)；鹽離子在發(fā)酵過程中起緩沖作用；金屬離子作為生長因子，對(duì)微生物的生長有促進(jìn)或抑制作用，例如Mn2+是超氧陰離子和H2O2的清除劑，通過保護(hù)菌株免受活性氧的毒害而對(duì)菌株的生長產(chǎn)生積極作用;微生物生長依賴于最適溫度和pH值，選擇其生長的最適環(huán)境，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的積累起重要作用[21-22]。

分別以MnSO4、CH3COONa、接種量、培養(yǎng)溫度、pH值和氮源種類作為考察因素，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4-a～圖4-d可知，對(duì)菌株zh產(chǎn)乳酸量影響較大的因素是MnSO4、CH3COONa、培養(yǎng)溫度和pH值。當(dāng)這4個(gè)因素發(fā)生改變時(shí)，乳酸的積累量變化顯著，而接種量對(duì)其影響較穩(wěn)定。氮源篩選結(jié)果(圖4-f)可知，zh菌株以酵母膏為氮源時(shí)，乳酸產(chǎn)量最高。因此在產(chǎn)乳酸條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分以0.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酵母膏為氮源、接種量2.0%、培養(yǎng)120 h，考察MnSO4、CH3COONa、培養(yǎng)溫度和pH值對(duì)乳酸產(chǎn)量的相互影響。

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取MnSO4、CH3COONa、培養(yǎng)溫度和pH值這4個(gè)因素(表3)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表3 菌株zh正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal tests

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，影響因素的排序?yàn)镃>A>D>B，培養(yǎng)溫度對(duì)菌株zh產(chǎn)乳酸影響最大，其次是MnSO4添加量和pH值，CH3COONa添加量對(duì)其影響最小，優(yōu)化后的理論工藝參數(shù)為A2B2C3D1；方差分析結(jié)果表明C影響極顯著，P<0.01；A影響顯著，P<0.05。確定的最優(yōu)發(fā)酵條件為：最佳氮源為酵母膏，氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%、MnSO40.6 g/L、CH3COONa 7 g/L、pH 4、接種量2.0%、培養(yǎng)溫度34 ℃，搖瓶發(fā)酵120 h，此時(shí)菌株zh產(chǎn)乳酸的量可達(dá)到13.99 g/100g(菊芋干粉)。

為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可行性，將優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行產(chǎn)乳酸驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次取平均值，實(shí)際的乳酸產(chǎn)量可達(dá)到14.37 g/100g(菊芋干粉)，因此菌株zh產(chǎn)乳酸穩(wěn)定且重復(fù)性好。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result s of orthogonal experiment

表5 方差分析結(jié)果表Table 5 The results of variance analysis

a-MnSO4添加量；b-CH3COONa添加量；c-培養(yǎng)溫度；d-pH值；e-接種量；f-氮源種類圖4 菌株zh產(chǎn)乳酸單因素圖Fig.4 Single factor diagram of lactic acid production by strain zh

2.2.3 旋光度的測定

將粗制所得的乳酸樣品稀釋至7.5 g/L，在589.44 nm鈉單色光源下測定其旋光度，其旋光度平均值為+0.153。L-乳酸旋光度為(+)，D-乳酸旋光度為(-)，乳酸標(biāo)樣經(jīng)高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)進(jìn)行分析后，其色譜圖如圖5所示，D-乳酸和L-乳酸保留時(shí)間分別為3.453 min和4.454 min。由所測樣品旋光度值可初步判斷，本研究中通過菊糖酶解液所得到乳酸為外消旋體[23]。

1-D-乳酸;2-L-乳酸圖5 乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品液相色譜圖Fig.5 The HPLC chromatogram of lactic acid standard

3 結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)篩選出1株可發(fā)酵轉(zhuǎn)化菊糖酶解液的菌株zh，通過菌落形態(tài)觀察、生理生化及16S rDNA序列分析，確定該菌株為植物乳桿菌(L.plantarum)。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了zh菌株發(fā)酵菊糖酶解液制備L-乳酸的工藝條件，其最佳培養(yǎng)條件為以酵母膏為氮源，氮源0.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，MnSO40.6 g/L、CH3COONa 7 g/L，菊芋酶解液定容，初始pH值4，接種量2.0%，培養(yǎng)溫度34 ℃，搖瓶發(fā)酵120 h。經(jīng)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)表明，菌株zh實(shí)際產(chǎn)乳酸量達(dá)到14.37 g/100g菊芋干粉。對(duì)制備的乳酸粗品進(jìn)行旋光性檢測，其平均旋光值為+0.153，初步判定試驗(yàn)所得乳酸為外消旋體。綜上所述，該菌株產(chǎn)酸量可觀，營養(yǎng)需求簡單，生產(chǎn)成本較低，能夠?yàn)榫沼蟮确羌Z原料生產(chǎn)L-乳酸的菌株篩選和產(chǎn)酸條件優(yōu)化提供一定借鑒。

隨著L-乳酸在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，降低成本是L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中的核心問題，而非糧原料或農(nóng)林副產(chǎn)物已成為低成本發(fā)酵原料的重要糖源。菊芋作為重要的能源經(jīng)濟(jì)作物，塊莖中菊糖含量約占干物質(zhì)的80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，是優(yōu)質(zhì)廉價(jià)的發(fā)酵原料之一。本試驗(yàn)僅是在搖瓶培養(yǎng)條件下的結(jié)果，發(fā)酵罐放大試驗(yàn)及工業(yè)化生產(chǎn)中運(yùn)用時(shí)的工藝條件還有待進(jìn)一步優(yōu)化。可通過對(duì)生產(chǎn)菌株的誘變選育，并考慮同步糖化發(fā)酵的連續(xù)工藝，進(jìn)一步提高L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)水平。