富含EPA/DHA型結(jié)構(gòu)磷脂的酶法合成條件優(yōu)化及表征

薛 靜 崔益瑋 沈 清 鄭振霄 戴志遠(yuǎn),*

(1浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012)

磷脂是細(xì)胞膜的重要組成部分，承擔(dān)了重要的生理功能[1]，在食品、化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。以二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)為代表的Omega-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸已被證實(shí)具有促進(jìn)視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育，提高機(jī)體免疫力，改善心臟健康和降低心血管疾病發(fā)病率等功能，甘油酯型和磷脂型是其主要的天然構(gòu)型[2-4]。研究表明，磷脂型DHA和EPA相此于甘油酯型和乙酯型具有諸多優(yōu)勢(shì)，如磷脂在體內(nèi)的吸收率遠(yuǎn)高于被動(dòng)吸收方式的甘油酯和乙酯，且磷脂型DHA和EPA沒(méi)有腥味，具有更好的穩(wěn)定性等[5-7]。隨著磷脂型Omega-3脂肪酸受到越來(lái)越多的關(guān)注，富含EPA/DHA磷脂的制備方法也逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

目前，富含Omega-3脂肪酸的磷脂制備方法主要包括天然提取法[8-9]、微生物發(fā)酵法[10]、酶促轉(zhuǎn)化法[11]和化學(xué)合成法[12]等。含有EPA和DHA的天然磷脂主要存在于海產(chǎn)動(dòng)物的卵和肌肉組織中[13-14]，其產(chǎn)量和純度難以滿足市場(chǎng)的需求。相比于化學(xué)合成法，酶促轉(zhuǎn)化法具有選擇性高、條件溫和等特點(diǎn)[15]，更適合用于制備EPA/DHA型結(jié)構(gòu)磷脂。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此展開(kāi)了大量的研究[16-19]，如Li等[17]在無(wú)溶劑體系中，采用磷脂酶A1催化大豆磷脂與富含EPA、DHA的乙酯型魚(yú)油發(fā)生酯交換反應(yīng)，最大轉(zhuǎn)化率為30.7%；Li等[18]研究了水分添加量、真空處理等不同因素對(duì)酶促合成DHA/EPA型磷脂酰膽堿的影響，結(jié)果表明水分添加量高于0.5%時(shí)，磷脂酶A1的催化活力明顯增強(qiáng)；Marsaoui等[19]研究了不同溶劑體系和添加物對(duì)米黑根毛霉(Rhizomucormiehei) 脂肪酶催化大豆卵磷脂與乙酯型EPA和DHA酯交換反應(yīng)的影響，結(jié)果表明隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Mg2+和尿素的添加顯著提高了EPA和DHA的結(jié)合率。然而，多數(shù)研究仍以不含EPA和DHA的植物大豆磷脂為合成原料，受限于磷脂酶的專(zhuān)一催化特性，產(chǎn)物磷脂中的DHA/EPA含量仍難以達(dá)到較高水平。且大多數(shù)研究?jī)H采用薄層色譜(thin-layer chromatography, TLC)和氣相色譜(gas chromatography，GC)等對(duì)產(chǎn)物磷脂進(jìn)行總脂肪酸含量的測(cè)定，難以準(zhǔn)確表征磷脂分子結(jié)構(gòu)在酶反應(yīng)前后發(fā)生的變化。傳統(tǒng)的TLC和正相液相色譜(normal-phase high performance liquid chromatography, NP-HPLC)無(wú)法與質(zhì)譜聯(lián)用，親水作用色譜(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC)是專(zhuān)門(mén)分離強(qiáng)極性和親水性化合物的一種方法，具有較好的質(zhì)譜兼容性，親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry, HILIC-MS)技術(shù)亦成為研究磷脂分子結(jié)構(gòu)的有效方法[20]。

本研究以南極磷蝦磷脂為原料，以EPA和DHA總結(jié)合率為指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化富含EPA/DHA型結(jié)構(gòu)磷脂的酶法合成反應(yīng)參數(shù)，進(jìn)一步提高結(jié)構(gòu)磷脂中EPA和DHA的含量，并采用GC和HILIC-MS技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以期為探索和豐富酶促合成EPA/DHA型結(jié)構(gòu)磷脂的機(jī)理和實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦油，購(gòu)自遼漁南極磷蝦科技發(fā)展有限公司；磷脂酰膽堿(phosphatidylcholines, PC)，溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自美國(guó)Avanti Polar-Lipids；固定化磷脂酶A1，實(shí)驗(yàn)室自制(水分含量1.7%，酶活795 U·g-1)；37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酯型魚(yú)油，購(gòu)自浙江海力生集團(tuán)有限公司；磷脂酶A1(Lecitase Ultra)，購(gòu)自丹麥諾維信公司；乙腈(色譜純)，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、乙醚、乙酸、丙酮、三氯甲烷、甲醇、石油醚、無(wú)水硫酸鈉等均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

4000Q-TRAP三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(ESI離子源)，美國(guó)Applied Biosystems公司；HPLC高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司；7890B氣相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Fresco-21G臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher公司；Millipore超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；BSD-YX2200恒溫?fù)u床，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 游離脂肪酸的制備 參考張蒙娜等[21]的方法對(duì)乙酯型魚(yú)油中的EPA和DHA進(jìn)行富集，并采用Garcia等[22]的方法制備游離脂肪酸，充氮密封，低溫保存待用。經(jīng)測(cè)定，游離脂肪酸中EPA相對(duì)含量為60.63%，DHA相對(duì)含量為24.57%。

1.3.2 南極磷蝦磷脂的提取 采用Folch等[8]的方法提取南極磷蝦總脂，加入一定體積冷丙酮(0℃)，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，收集沉淀并用大量冷丙酮多次洗滌，取上清液滴于潔凈玻片上，迅速揮干無(wú)油跡后，氮吹干，充氮，低溫保存待用。

1.3.3 固定化酶催化合成結(jié)構(gòu)磷脂 稱(chēng)取1 g南極磷蝦磷脂于50 mL具塞三角燒瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)比例加入游離脂肪酸、正己烷和水，充分混勻后加入一定質(zhì)量的固定化磷脂酶A1，充氮密封，置于恒溫空氣搖床，200 r·min-1反應(yīng)24 h后，過(guò)濾去除固定化磷脂酶A1，收集反應(yīng)液。用正己烷多次淋洗固定化磷脂酶A1，收集淋洗液。將淋洗液與反應(yīng)液混合，并旋蒸脫溶。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 單因素試驗(yàn) 固定正己烷添加量為3 mL，反應(yīng)時(shí)間為24 h，分別研究底物質(zhì)量比(游離脂肪酸:磷脂，m/m)，酶添加量(以反應(yīng)底物的總質(zhì)量計(jì))，反應(yīng)溫度以及水分添加量(以反應(yīng)底物的總質(zhì)量計(jì))4個(gè)單因素對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響。具體操作如下：(1)固定底物質(zhì)量比為4，酶添加量為15%，反應(yīng)溫度為50℃，研究水分添加量(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%)對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響。(2)固定底物質(zhì)量比為4，水分添加量為1.00%，反應(yīng)溫度為50℃，研究酶添加量(5%、10%、15%、20%、25%、30%)對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響。(3)固定水分添加量為1.00%，酶添加量為20%，反應(yīng)溫度為50℃，研究底物質(zhì)量比A(2、3、4、5、6、7)對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響。(4)固定底物質(zhì)量比為5，水分添加量為1.00%，酶添加量為20%，研究反應(yīng)溫度(40、45、50、55、60℃)對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響。

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Design Expert 8.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，選取底物質(zhì)量比A(游離脂肪酸∶磷脂，m/m)、反應(yīng)溫度B和水分添加量C(以反應(yīng)底物總質(zhì)量計(jì))3個(gè)因素為自變量，以DHA和EPA的總結(jié)合率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的中心組合試驗(yàn)，以確定富含EPA/DHA型結(jié)構(gòu)磷脂最佳酶反應(yīng)參數(shù)。響應(yīng)面因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平表Table 1 Levels and factors of response surface methodology (RSM)

1.3.5 反應(yīng)產(chǎn)物的TLC檢測(cè) 參考Zhao等[23]的方法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行TLC檢測(cè)，并做適當(dāng)修改。取100 mg脫溶后的反應(yīng)產(chǎn)物溶解于1 mL三氯甲烷中，毛細(xì)管點(diǎn)樣于TLC硅膠板上，以三氯甲烷∶甲醇∶乙酸∶水(75∶40∶8∶3，v/v/v/v)為展開(kāi)液，碘蒸氣顯色。

1.3.6 GC測(cè)定脂肪酸組成 將TLC硅膠板上對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)磷脂條帶刮下，并加入5 mL 0.5 mol·L-1氫氧化鉀-甲醇溶液，于65℃水浴30 min，冷卻后加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，于65℃水浴5 min，超聲提取10 min后加入2 mL正己烷，振搖后用2 mL飽和氯化鈉淋洗上層，取上層用無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾待測(cè)。

GC條件：HP-88毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.20 μm)；升溫程序：初溫70℃保持1 min，以4℃·min-1升至180℃，保持5 min；再以3℃·min-1升至230℃，保持5 min，進(jìn)樣口溫度250℃，分流比30∶1，進(jìn)樣量1 μL，載氣流速1 mL·min-1。采用峰面積歸一化法分析各脂肪酸組分的相對(duì)含量。每組樣品重復(fù)測(cè)試3次。

1.3.7 HILIC-MS測(cè)定磷脂結(jié)構(gòu) 最優(yōu)條件下反應(yīng)結(jié)束后，取一定量脫溶后的反應(yīng)混合物，采用氯仿-甲醇溶液(2∶1，v/v)進(jìn)行稀釋?zhuān)?.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后靜置用于質(zhì)譜分析。

液相條件：色譜柱：Cosmosil HILIC色譜柱(4.6 mm×250 mm，2.5 μm)；流動(dòng)相A：超純水(20 mmol·L-1甲酸銨，18 mmol·L-1甲酸)；流動(dòng)相B：乙腈(18 mmol·L-1甲酸)。梯度洗脫程序[24]：0 min(95% B)，3 min(95% B)，18 min(70% B)，23 min(50% B)，28 min(50% B)，29 min(95% B)，32 min(95% B)。流量0.6 mL·min-1；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源ESI負(fù)離子模式；離子源電壓(IS)4.5 kV；毛細(xì)管溫度500℃；氣簾氣(CUR)25 psi；霧化氣(GS1)24 psi；輔助氣(GS2)30 psi；掃描范圍400～1 000 m/z[25]。采用峰面積歸一化法分析各磷脂分子種組分的相對(duì)含量。每組樣品重復(fù)測(cè)試3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst Software v1.6.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采用Lipid View 1.2進(jìn)行磷脂分子種鑒定，采用Excel 2010和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 水分添加量對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響 由圖1可知，水分添加量為0.25%～1.00%時(shí)，EPA/DHA結(jié)合率隨著水分添加量的增加而增加，但隨著水分含量的繼續(xù)增加，EPA/DHA結(jié)合率逐漸下降。分析原因可能是在較低水分活度下，磷脂酶的構(gòu)象過(guò)于“剛性”而無(wú)法發(fā)揮催化活力，而磷脂酶由于兼具水解和酯化的雙重催化活性，當(dāng)體系中的水分過(guò)高時(shí)，加速了水解副反應(yīng)的發(fā)生，從而導(dǎo)致EPA/DHA結(jié)合率下降。因此，選定水分添加量為1.00%進(jìn)行下一步的優(yōu)化。

圖1 水分添加量對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of water addition on the acidolysis reaction

圖2 酶添加量對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of enzyme loading on the acidolysis reaction

2.1.2 固定化酶添加量對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響 由圖2可知，隨著酶添加量的增加，EPA/DHA結(jié)合率整體呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量超過(guò)20%時(shí)，EPA/DHA結(jié)合率的增幅減緩，這與Zhao等[23]的研究結(jié)果基本一致。分析原因，可能是由于酶促反應(yīng)的速度取決于酶和底物生成的中間復(fù)合物的濃度，隨著磷脂酶含量的逐漸增加，其活性基團(tuán)不斷增多，中間物濃度不斷增加，酶促反應(yīng)加速；而由于受底物濃度限制，中間復(fù)合物達(dá)到飽和后，酶促反應(yīng)趨于平衡，繼續(xù)增加酶添加量，反應(yīng)速率變化不大。從酶的利用角度出發(fā)，選擇固定酶添加量為20%進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.1.3 底物質(zhì)量比對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響 由圖3可知，隨著底物質(zhì)量比中游離脂肪酸含量的增加，DHA/EPA結(jié)合率呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì)。這可能是由于隨著酶促反應(yīng)的進(jìn)行，原料磷脂sn-1位上的非目標(biāo)脂肪酸鏈被替換下來(lái)，導(dǎo)致底物中的EPA和DHA被逐漸稀釋?zhuān)繕?biāo)脂肪酸鏈與磷脂的接觸率降低，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，因此適當(dāng)增大游離脂肪酸的比例有助于提高目標(biāo)脂肪酸鏈與磷脂的接觸率。但隨著游離脂肪酸含量的繼續(xù)增加，底物濃度已趨于飽和，一方面，底物黏度的增大阻礙了酶與底物之間的充分接觸，另一方面，游離脂肪酸中殘存的水分增加了體系中的水分含量，從而致使結(jié)合率不增反減。因此，選擇底物質(zhì)量比為5進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 底物質(zhì)量比對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of substrate mass ratio on the acidolysis reaction

2.1.4 反應(yīng)溫度對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響 由圖4可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，EPA/DHA結(jié)合率呈先增加后減小的趨勢(shì)。分析原因可能是，在較低溫度下，磷脂酶A1的水解活性高于酯化活性，催化反應(yīng)更趨向于朝著水解的方向進(jìn)行；隨著反應(yīng)溫度的升高，酶催化酯化的活性增強(qiáng)，反應(yīng)體系黏度降低，底物與酶的接觸更加充分，從而促進(jìn)了EPA/DHA和磷脂的結(jié)合。當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)酶的最適溫度時(shí)，酶的活性將受到抑制，甚至喪失活性，從而表現(xiàn)為DHA/EPA結(jié)合率降低。Garcia等[22]研究認(rèn)為固定化磷脂酶A1在50～60℃之間可催化獲得最高轉(zhuǎn)化率，這與本研究結(jié)果一致。因此，選定55℃為酶催化磷脂酸解反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的方差分析 對(duì)表2所得結(jié)果進(jìn)行回歸建模分析，并對(duì)所得回歸模型做方差分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。最終得到回歸方程為：

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)磷脂酸解反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of temperature on the acidolysis reaction

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The Box-Behnken design and results

EPA/DHA結(jié)合率=63.64+0.79A+0.59B-1.57C-0.30AB-0.53AC+0.025BC-3.15A2-6.05B2-2.57C2。

模型F值為107.28，P值<0.000 1，差異極顯著；模型失擬項(xiàng)F值為2.49，P值為0.199 5>0.05，不顯著；從擬合方程的相關(guān)系數(shù)可見(jiàn)，多元二次方程擬合相關(guān)系數(shù)高于0.90，擬合的回歸模型可用來(lái)預(yù)測(cè)響應(yīng)值與反應(yīng)參數(shù)之間的關(guān)系。由表3可知，A、B、C、A2、B2和C2的P值均小于0.05，說(shuō)明A(底物質(zhì)量比)、B(反應(yīng)溫度)、C(水分添加量)的主效應(yīng)顯著，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著影響，其中水分添加量(C)是影響EPA/DHA結(jié)合率的最主要因素。

表3 二項(xiàng)式回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Model-fitting results and analysis of variance

Note：*indicates significant difference at 0.05 level. **indicates extremely significant difference at 0.01 level.

圖5 底物質(zhì)量比與反應(yīng)溫度對(duì)EPA/DHA結(jié)合率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.5 Response surface and its contour plots for the interactive effect of substrate mass ratio and temperature on the level of incorporation of EPA and DHA

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析結(jié)果 根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)值EPA/DHA結(jié)合率與3個(gè)因素的等高線及響應(yīng)面圖。由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)溫度和底物質(zhì)量比處于較低水平時(shí)，EPA/DHA結(jié)合率隨著二者的增加而明顯提高，當(dāng)繼續(xù)增加至較高水平時(shí)，EPA/DHA結(jié)合率隨之緩慢下降。結(jié)合表3數(shù)據(jù)，A(底物質(zhì)量比)和B(反應(yīng)溫度)對(duì)EPA/DHA結(jié)合率具有顯著影響，兩者相比，A(底物質(zhì)量比)對(duì)EPA/DHA結(jié)合率的影響較大，而兩者的交互作用不顯著。同理，結(jié)合圖6～7和表3可知，A(底物質(zhì)量比)和C(水分添加量)之間的交互作用，以及B(反應(yīng)溫度)和C(水分添加量)之間的交互作用均不顯著。

圖6 反應(yīng)溫度與水分添加量對(duì)EPA/DHA結(jié)合率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.6 Response surface and its contour plots for the interactive effect of temperature and water addition on the level of incorporation of EPA and DHA

圖7 底物質(zhì)量比與水分添加量對(duì)EPA/DHA結(jié)合率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.7 Response surface and its contour plots for the interactive effect of substrate mass ratio and water addition on the level of incorporation of EPA and DHA

通過(guò)對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果的分析，確定回歸模型預(yù)測(cè)的最佳反應(yīng)參數(shù)：底物質(zhì)量比5.15，反應(yīng)溫度55.22℃，水分添加量0.92%，此條件下預(yù)測(cè)EPA/DHA結(jié)合率為63.97%。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)?？紤]試驗(yàn)的可操作性，將反應(yīng)溫度調(diào)整為55.2℃，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。試驗(yàn)組平均值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差小于1%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的工藝參數(shù)具有較高的可行性。

表4 響應(yīng)面模型驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The validation test results of the response surface mode /%

2.3 原料磷脂及結(jié)構(gòu)磷脂的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 脂肪酸組成分析 由圖8和表5可知，原料磷脂中含量最高的脂肪酸為EPA，其次為C16：0、DHA和C18：1；結(jié)構(gòu)磷脂中含量最高的脂肪酸為EPA，其次為DHA、C16：0和C18：1。對(duì)比磷脂反應(yīng)前后的脂肪酸組成發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)酸解反應(yīng)，結(jié)構(gòu)磷脂中的EPA和DHA等高不飽和脂肪酸含量顯著增加，而C14：0、C16：0以及C18：1等飽和脂肪酸和低不飽和脂肪酸含量顯著降低。

注：A：結(jié)構(gòu)磷脂；B：原料磷脂。Note：A: Structured phospholipids. B: Raw phospholipids material.圖8 原料磷脂和結(jié)構(gòu)磷脂氣相色譜圖譜Fig.8 The GC chromatography of structured phospholipids and raw phospholipids material

表5 原料磷脂和結(jié)構(gòu)磷脂主要脂肪酸組成Table 5 The composition of main fatty acids in raw phospholipids material and structured phospholipids

2.3.2 磷脂分子種組成分析 原料磷脂和結(jié)構(gòu)磷脂的PC和LPC質(zhì)譜圖見(jiàn)圖9～10。結(jié)果表明，原料磷脂PC組分的m/z多集中在796.9～852.9之間，且m/z 824.7和m/z 850.8等峰豐度較大；LPC組分的m/z多集中在540.7～612.5之間，m/z 540.7和m/z 586.6等峰豐度較大。結(jié)構(gòu)磷脂的PC和LPC組分的m/z分布較原料磷脂發(fā)生明顯偏移，其中，PC組分m/z多集中在808.9～898.8之間，且m/z 870.9和m/z 896.8等峰豐度較大；LPC組分豐度較高的峰為m/z 586.7、m/z 612.7和m/z 526.8。

由LipidView軟件進(jìn)行定性分析，并通過(guò)歸一化法對(duì)已鑒定的磷脂分子進(jìn)行相對(duì)含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。原料磷脂和結(jié)構(gòu)磷脂中共鑒定出PC分子46種，LPC分子20種。其中，PC組分的C原子總數(shù)為32～44個(gè)，雙鍵數(shù)為0～12個(gè)；LPC組分的C原子總數(shù)為14～22個(gè)，雙鍵數(shù)為0～6個(gè)。

原料磷脂的PC亞類(lèi)中，36：5(16：0/20：5)、38：6 (16：0/22：6&18：1/20：5)和34：1(16：0/18：1)等分子種的相對(duì)含量較高，分別占17.57%、12.54%和6.47%；LPC亞類(lèi)中，16：0(16：0/0：0)、20：5 (20：5/0：0)、18：1 (18：1/0：0)和22：6(22：6/0：0)等分子種的相對(duì)含量較高，分別占30.72%、16.68%、11.69%和10.28%。此外，還檢測(cè)到40:10(20：5/20：5)、42:11(20：5/22：6)和44:12(22：6/22：6)等接近滿飽和度的PC分子種，但相對(duì)含量較低，僅占1.87%、4.43%和1.29%。

注：A：PC組分質(zhì)譜圖；B：LPC組分質(zhì)譜圖。Note: A: Mass spectra of PC. B: Mass spectra of LPC.圖9 原料磷脂質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectra of raw phospholipids material

注：A：PC組分質(zhì)譜圖；B：LPC組分質(zhì)譜圖。Note: A: Mass spectra of PC. B: Mass spectra of LPC.圖10 結(jié)構(gòu)磷脂質(zhì)譜圖Fig.10 Mass spectra of structured phospholipids

表6 原料磷脂和結(jié)構(gòu)磷脂分子種組成分析Table 6 Analysis of molecular species composition of raw phospholipids material and structured phospholipids

表6(續(xù))

表6(續(xù))

結(jié)構(gòu)磷脂的PC亞類(lèi)中，36：5(16：0/20：5)、38：6 (16：0/22：6&18：1/20：5)和34：1(16：0/18：1)等分子種的相對(duì)含量較原料磷脂顯著下降，而40:10(20：5/20：5)和42:11(20：5/22：6)等分子種的相對(duì)含量較原料磷脂提高了16.59和8.35個(gè)百分點(diǎn)，分別占18.46%和12.78%；LPC亞類(lèi)中16：0(16：0/0：0)和18：1 (18：1/0：0)等分子種的相對(duì)含量較原料磷脂顯著下降，而20：5(20：5/0：0)和22：6(22：6/0：0)分子種的相對(duì)含量較原料磷脂提高了17.72和15.71個(gè)百分點(diǎn)，分別占34.40%和25.99%。

以脂肪酸單鏈平均長(zhǎng)度≥20作為磷脂分子長(zhǎng)鏈脂肪酸相對(duì)含量的參考，以雙鍵數(shù)≥5和雙鍵數(shù)≥10作為磷脂分子中高不飽和脂肪酸相對(duì)含量的參考，對(duì)比磷脂反應(yīng)前后的差異發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)磷脂的PC和LPC組分中脂肪酸單鏈平均長(zhǎng)度≥20的分子種的相對(duì)含量分別為54.24%和72.64%，較原料磷脂分別提高了33.12和37.28個(gè)百分點(diǎn)；結(jié)構(gòu)磷脂的PC組分中雙鍵數(shù)≥5和雙鍵數(shù)≥10的分子種相對(duì)含量分別為93.48%和37.65%，較原料磷脂分別升高了24.89和27.53個(gè)百分點(diǎn)；結(jié)構(gòu)磷脂的LPC組分中雙鍵數(shù)≥5的分子種相對(duì)含量為64.12%，較原料磷脂提高了35.62個(gè)百分點(diǎn)；此外，PC/LPC顯著下降，說(shuō)明經(jīng)酶催化酸解反應(yīng)，磷脂的組成發(fā)生了顯著變化，磷脂中的部分PC轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)PC。

綜上，經(jīng)過(guò)酶催化酸解反應(yīng)后，結(jié)構(gòu)磷脂中脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和不飽和程度均發(fā)生了顯著變化，其脂肪酸鏈中具有更多的長(zhǎng)鏈高不飽和脂肪酸EPA和DHA。

3 討論

3.1 富含EPA/DHA型磷脂酶合成反應(yīng)條件優(yōu)化

為制備富含EPA/DHA型磷脂，國(guó)內(nèi)外學(xué)者展開(kāi)了大量的研究。其中大多數(shù)研究采用不含EPA/DHA的大豆卵磷脂和不同酰基供體形式的EPA/DHA為反應(yīng)原料，但由于磷脂酶專(zhuān)一催化的特性，產(chǎn)物磷脂中的EPA/DHA含量難以獲得進(jìn)一步提升。南極磷蝦是富含天然磷脂的優(yōu)質(zhì)資源[27-28]，具有較高的深度開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。本研究從南極磷蝦油中提取磷脂，經(jīng)測(cè)定其EPA和DHA含量分別為25.32%和15.31%，這與孫甜甜等[29]的研究結(jié)果基本一致。研究認(rèn)為，Omega-3多不飽和脂肪酸易結(jié)合在磷脂的sn-2位[30]，而sn-1位脂肪酸通常為飽和脂肪酸或低不飽和脂肪酸。利用磷脂酶A1的sn-1位專(zhuān)一催化活性，催化南極磷蝦磷脂sn-1位脂肪酸鏈與EPA/DHA進(jìn)行交換，并最大程度保留sn-2位EPA/DHA，將成為進(jìn)一步提高磷脂中EPA/DHA含量的新途徑。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法分析了水分添加量、底物質(zhì)量比和反應(yīng)溫度與EPA/DHA結(jié)合率的關(guān)系。結(jié)果顯示，3個(gè)因素對(duì)EPA/DHA結(jié)合率均有顯著影響，其中水分添加量對(duì)EPA/DHA結(jié)合率的影響極顯著。李響[31]研究表明，水分添加量對(duì)產(chǎn)物中EPA/DHA結(jié)合率、PC、LPC和甘油磷脂酰膽堿(glycerophosphorylcholine, GPC)含量均具有顯著影響，其中水分添加量是影響DHA/EPA結(jié)合率和產(chǎn)物組成的最主要因素，最優(yōu)水分添加量為1.28%。Li等[18]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了固定化酶A1催化合成DHA/EPA型磷脂的最優(yōu)反應(yīng)參數(shù)，得出最佳水分添加量為1.1 wt%。本研究與前人研究基本一致，但水分添加量的最優(yōu)值存在一定差異，這可能是因?yàn)榇蠖孤蚜字湍蠘O磷蝦磷脂原料以及反應(yīng)體系存在差別。由于南極磷蝦磷脂本身含有一定量的EPA/DHA，適當(dāng)降低水分添加量可避免磷脂原料中固有的EPA/DHA發(fā)生過(guò)度水解，故本試驗(yàn)確定的最優(yōu)水分添加量較前人報(bào)道偏低。水解反應(yīng)是完成酶催化磷脂酸解反應(yīng)過(guò)程中不可避免的副反應(yīng)[32]，適當(dāng)?shù)奶砑铀挚梢源偈沽字猱a(chǎn)生溶血磷脂，而溶血磷脂作為酯交換反應(yīng)的中間體可以促進(jìn)酯交換反應(yīng)的進(jìn)行[33]。因此，適宜的水分添加量是制備富含EPA/DHA型磷脂的關(guān)鍵。

3.2 原料磷脂和結(jié)構(gòu)磷脂的表征

經(jīng)分析，實(shí)驗(yàn)室自制南極磷蝦磷脂的主要成分為PC和LPC(總含量>90%)，還存在少量的磷酯酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)，這與胡劼等[34]的研究結(jié)果一致。因此，本試驗(yàn)以PC和LPC為主要研究對(duì)象。

結(jié)合氣相色譜和液相質(zhì)譜試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及前人的研究成果[20,24-26]綜合分析可知，原料磷脂的sn-1位脂肪酸主要為C16:0、C18:1、C14:0、C18:0等，而EPA和DHA等高不飽和脂肪酸主要位于磷脂的sn-2位，由此推測(cè)含量較高的PC亞類(lèi)的結(jié)構(gòu)依次為36：5(16：0/20：5)、38：6(18：1/20：5&16：0/22：6)和34：1 (16：0/18：1)，LPC亞類(lèi)依次為16：0(16：0/0：0)、20：5(20：5/0：0)、18：1(18：1/0：0)和22：6 (22：6/0：0)。由于磷脂酶A1專(zhuān)一作用于磷脂分子的sn-1位酯鍵，可首先水解PC分子的sn-1位脂肪酸生成sn-2-LPC[35]，并催化后者與高不飽和脂肪酸進(jìn)行酯化反應(yīng)，從而提高磷脂中高不飽和脂肪酸的含量。另一方面，sn-2-LPC可經(jīng)酰基轉(zhuǎn)移作用轉(zhuǎn)換為sn-1-LPC[36]，后者在磷脂酶A1的催化下可進(jìn)一步水解生成GPC，從而導(dǎo)致磷脂得率以及EPA/DHA含量下降。由于EPA和DHA為脂肪酸鏈長(zhǎng)度≥20，雙鍵數(shù)≥5的高不飽和脂肪酸，由此推測(cè)原料磷脂在磷脂酶A1催化作用下的理論產(chǎn)物主要為一系列雙鍵數(shù)≥5的PC和LPC分子種，其中亦包含部分雙鍵數(shù)≥10的PC分子種，如40:10(20：5/20：5)、42:11(20：5/22：6)、44:12(22：6/22：6)等。脂肪酸單鏈平均長(zhǎng)度≥20可作為磷脂分子長(zhǎng)鏈脂肪酸相對(duì)含量的參考，而雙鍵數(shù)≥5和雙鍵數(shù)≥10可作為磷脂分子中高不飽和脂肪酸相對(duì)含量的參考，以上參數(shù)是判斷酯交換反應(yīng)效果的有力指標(biāo)。表6數(shù)據(jù)也說(shuō)明，在磷脂酶A1的催化作用下，磷脂分子中的中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸和低不飽和脂肪酸與反應(yīng)底物中的長(zhǎng)鏈高不飽和脂肪酸發(fā)生了高效的交換。

此外，以PC/LPC作為水解程度的參考，對(duì)比磷脂反應(yīng)前后的差異發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)磷脂的PC/LPC較原料磷脂顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了磷脂水解反應(yīng)的發(fā)生。這一現(xiàn)象與Kim等[37]和李響[31]的研究結(jié)果基本一致。Kim等[37]研究表明，隨著Omega-3多不飽和脂肪酸結(jié)合率的提高，PC含量明顯降低。李響[31]采用核磁共振波譜儀對(duì)最終產(chǎn)物磷脂的組成進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)的進(jìn)行，PC逐漸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)PC(57.7%)和GPC(25.8%)。研究表明，LPC的乳化性、滲透性、表面活性等性能均優(yōu)于普通磷脂[38]，其在食品、畜牧、醫(yī)藥等行業(yè)具有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[39-40]。

4 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法對(duì)富含EPA/DHA型結(jié)構(gòu)磷脂的酶法合成反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)條件為：底物質(zhì)量比5.15，反應(yīng)溫度55.22℃，水分添加量0.92%，酶添加量20%，正己烷3 mL，反應(yīng)時(shí)間24 h，所得結(jié)構(gòu)磷脂中EPA/DHA結(jié)合率高達(dá)64.35%。通過(guò)對(duì)磷脂反應(yīng)前后的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行表征，證實(shí)了以sn-2位富含EPA/DHA的磷脂為原料，結(jié)合具有sn-1位專(zhuān)一催化活性的磷脂酶A1，制備富含EPA/DHA型磷脂(包括溶血磷脂)具有一定的可行性。本研究為制備富含EPA/DHA型結(jié)構(gòu)磷脂提供了新的思路，但本研究尚未對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的貯藏特性及功能活性等進(jìn)行驗(yàn)證，今后將繼續(xù)開(kāi)展結(jié)構(gòu)磷脂的分離純化技術(shù)及功能活性等研究，以制備滿足不同需求的磷脂產(chǎn)品。