基于宏基因組的二代測序技術(shù)對(duì)下呼吸道感染診斷價(jià)值的綜述

房利利，張 永

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 蚌埠 233000)

感染性疾病是世界公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，在2016年的全球健康評(píng)估中，下呼吸道感染仍然位居低收入國家死亡首位，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1-2]。目前，臨床常用的病原學(xué)檢查技術(shù)(顯微鏡檢查、培養(yǎng)、血清學(xué)及傳統(tǒng)分子生物學(xué)手段)常常存在陽性率低、漏診率高、時(shí)效性差等局限。病原學(xué)診斷不明確導(dǎo)致治療延后、藥物濫用、耐藥性增加、經(jīng)驗(yàn)抗感染治療等現(xiàn)象。因此，肺部感染病原學(xué)的精準(zhǔn)診斷對(duì)于優(yōu)化抗感染治療至關(guān)重要。二代測序技術(shù)的出現(xiàn)開啟了微生物宏基因組學(xué)領(lǐng)域，也開啟了感染性疾病病原體的精準(zhǔn)診斷新篇章。

1 二代測序技術(shù)(next-generation sequen-cing,NGS)

二代測序也稱為高通量測序或大規(guī)模并行測序，該方法使得數(shù)以億計(jì)的基因片段同時(shí)或獨(dú)立測序，可以從時(shí)間、效率和成本上讓微生物組研究成為可能。該技術(shù)總體可分為宏基因組測序(metagenomics next-gennerationsequencing,mNGS)和靶向擴(kuò)增子測序(targeted-ampliconsequencing,TAS)，其一般測序流程包括標(biāo)本中核酸提取、DNA和(或)RNA富集、文庫制備、高通量測序和生物信息學(xué)分析等。mNGS是對(duì)整個(gè)DNA和/或RNA(轉(zhuǎn)錄成cDNA后)進(jìn)行測序(DNAseq和RNAseq)。mNGS可在一個(gè)單一的測試中鑒定出幾乎所有的病原體，包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲[3]，且可以識(shí)別罕見及新發(fā)現(xiàn)的病原體。此外，測序數(shù)據(jù)還可以間接用于其他的分析，例如通過RNAseq獲取轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)來分析微生物特征和人類宿主反應(yīng)。然而mNGS是大海撈針，因?yàn)橹挥行〔糠?通常小于1%)的測序讀數(shù)是非人類的，且其中只有小部分可能與潛在的病原體相對(duì)應(yīng)。因此，該方法的敏感性依賴于背景菌群水平。TAS具有增加測序數(shù)據(jù)中病原菌序列數(shù)和比例的優(yōu)點(diǎn)。靶向測序是使用高度保守的引物進(jìn)行一般PCR擴(kuò)增，然后從臨床樣本中檢測與特定類型相對(duì)應(yīng)的所有微生物，如：用于檢測細(xì)菌的16S核糖體RNA的基因擴(kuò)增，以及用于檢測真菌的18S核糖體RNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的基因擴(kuò)增。靶向NGS方法的另一個(gè)例子是設(shè)計(jì)橫跨基因組的引物，促進(jìn)PCR擴(kuò)增，以便直接從臨床樣本中獲得病毒基因組[4]。已有許多醫(yī)院已經(jīng)將該技術(shù)引用到臨床樣本檢測中，從而增加了感染性疾病診斷的數(shù)量和比例[5]。mNGS是對(duì)樣本中所有基因組進(jìn)行測序，具有廣覆蓋優(yōu)勢，可以識(shí)別病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲、少見及新的病原體，并且它可以擴(kuò)展微生物種群的特征，包括亞型、抗生素耐藥性和致病基因的攜帶。TAS是針對(duì)特定微生物種群進(jìn)行檢測，相較于宏基因組測序，其測序深度較深、花費(fèi)相對(duì)較低，但它無法分類到具體物種，且受到檢測范圍的限制(如只能檢測細(xì)菌或真菌，甚至僅檢測分枝桿菌)以及需要對(duì)檢測樣本有預(yù)先判斷。隨著NGS和生物信息學(xué)的日益普及，宏基因組技術(shù)作為一種新型的感染性疾病診斷方法正逐步得到應(yīng)用。

2 下呼吸道存在的正常菌群

目前人們認(rèn)為健康人的下呼吸道由多種微生物組成的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，這些微生物也包括潛在的致病菌。下呼吸道微生物主要來源于口咽部的微吸入、周圍空氣的吸入及黏膜表面的直接彌散。肺部微生物組接近于口腔微生物組，但又存在不同：口腔微吸入在夜間達(dá)到頂峰，在白天逐漸減弱，移入速度減慢，清除作用增強(qiáng)。這種晝夜變化導(dǎo)致了肺部微生物組與口腔微生物組的不同。呼吸道微生物組在早期生命中是動(dòng)態(tài)發(fā)展的，與出生方式、喂養(yǎng)方式、抗生素使用、生存環(huán)境等有關(guān)[6]。健康人肺內(nèi)存在氧分壓、PH值、溫度等生理參數(shù)細(xì)微區(qū)域變化，但目前研究并未發(fā)現(xiàn)健康人肺內(nèi)微生物存在明顯的差異[7]。Morris等人對(duì)美國8個(gè)城市的健康受試者的肺微生物組的分析研究表明[8]，在吸煙者和不吸煙者的口腔中，卟啉單胞菌屬Porphyromonas、奈瑟菌屬Neisseria及孿生菌屬Gemella等菌群存在差異，但下呼吸道菌群中沒有明顯差異，并且沒有發(fā)現(xiàn)明顯地域差距。Hilty及Molyneaux等人對(duì)英國健康人肺部微生物的研究表明，其中檢測到的最豐富的微生物與美國健康受試者相似[9]。綜上所述，雖然健康人肺部菌群受多種因素的影響具有個(gè)體差異，但是在總體上具有相同的特點(diǎn)。在健康人的下呼吸道廣泛存在著多種細(xì)菌，包括擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、梭桿菌門Fusobacteria、放線菌門Actinobacteria，其中以擬桿菌門(普氏菌屬Prevotella)及厚壁菌門(韋榮氏球菌屬Veillonella、鏈球菌屬Streptococcus)為主[8]。有研究者發(fā)現(xiàn)，相比于口腔，Tropherymawhipplei在肺中相對(duì)富集[7-8]。對(duì)于健康人肺部真菌組及病毒組微生物的相關(guān)研究較少，在健康人的肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)的真菌組最常見的是Davidiellaceae科，枝孢菌屬Cladosporium、散囊菌屬Eurotium、青霉屬Penicillium、曲霉菌屬Aspergillus、念珠菌屬Candida、新薩托菌屬Neosartorya、馬拉色霉菌屬M(fèi)alassezia、絲齒菌屬Hyphodontia、克魯維酵母屬Kluyveromyces和肺囊蟲屬Pneumocystis等[10]。健康人肺部真菌組的個(gè)體差異較大，即使罹患同一種疾病，不同患病個(gè)體的真菌群落有較大差別。對(duì)健康人肺部病毒組的研究表明主要以噬菌體及Anelloviridae家族成員為主[11]。

3 在下呼吸道感染診斷中的應(yīng)用

隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)健康人“無菌的肺部”也存在多種微生物，若肺部微生物多樣性降低或部分微生物豐度異常增高，會(huì)打破了微生物的動(dòng)態(tài)平衡及免疫穩(wěn)態(tài)而導(dǎo)致肺炎發(fā)生[12]。近些年來NGS應(yīng)用于肺部疾病的研究也越來越廣泛，包括肺囊性纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、下呼吸道感染等，其中mNGS應(yīng)用于下呼吸道感染顯示出巨大優(yōu)勢。胡必杰等人[13]對(duì)成人感染性疾病樣本同時(shí)進(jìn)行的mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測，回顧性診斷為感染性疾病有347例，其中有255例(73.5%)診斷為下呼吸道感染。研究發(fā)現(xiàn)：mNGS診斷感染性疾病的敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法(50.7% vs 35.2%；P<0.01)，而特異性無明顯差異(85.7% vs 89.1%；P=0.39)；對(duì)于結(jié)核分枝桿菌、病毒、厭氧菌及真菌微生物的診斷價(jià)值優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)；此外，mNGS較少受以往接觸抗生素的影響。聯(lián)合采用針對(duì)DNA和RNA的檢測手段(DNAseq與RNAseq)，Langelier等人[14]采用該方法對(duì)氣道樣本病原菌的確定具有更高的敏感度與特異度(100%和87.5%)，且RNAseq在78%的已鑒定微生物中產(chǎn)生了更豐富的序列，平均每個(gè)微生物的讀數(shù)是DNAseq的2.2倍，說明RNAseq在發(fā)現(xiàn)潛在致病微生物方面可能更具有優(yōu)勢。針對(duì)兒童下呼吸道感染診斷價(jià)值的研究，F(xiàn)arnaes等人[15]對(duì)15名診斷為社區(qū)獲得性肺炎兒童進(jìn)行了游離血漿測序，與傳統(tǒng)檢測方法相比，mNGS具有較高的敏感性(86% vs 47%)，而且，在這15名兒童中，有7名因mNGS結(jié)果改變了抗生素治療方案。說明mNGS亦可以提高兒童下呼吸道感染病原菌的檢出率，有利于精準(zhǔn)診療的臨床實(shí)施。對(duì)于免疫缺陷患者下呼吸道感染的研究，Zinter等人[16]對(duì)34名免疫缺陷兒童的下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行mNGS，結(jié)果在以前臨床診斷呈陰性的樣本中，有一半檢測出了潛在病原菌，因此，mNGS對(duì)于呼吸道病原體檢測敏感性大大提高。Leo等人[17]對(duì)一名白血病造血干細(xì)胞移植后出現(xiàn)肺部感染的成人患者的肺泡灌洗液進(jìn)行mNGS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可顯著提高對(duì)細(xì)菌和真菌的檢出率，并且可以識(shí)別出常規(guī)檢測方法不能檢測到的厭氧菌和病毒。除此之外，有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)mNGS可更早更準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)成人肺移植后免疫缺陷患者病毒的檢出率，對(duì)于特殊人群下呼吸道感染病原學(xué)確定意義重大，不僅可以早期實(shí)施精準(zhǔn)治療，還能改善免疫缺陷患者的臨床預(yù)后。

除了上述呼吸道標(biāo)本，李荷蘭等[18]對(duì)20例肺組織標(biāo)本進(jìn)行了mNGS，其中有15例被mNGS成功鑒別出感染性病原菌。相對(duì)于組織病理學(xué)方法，mNGS對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、真菌具有較高的敏感度與特異度(100%和90%；94.1%和100%)。相對(duì)于培養(yǎng)方法，mNGS對(duì)細(xì)菌和真菌陰性預(yù)測值較高(100%和72.7%)；但同時(shí)發(fā)現(xiàn)其陽性預(yù)測值偏低(細(xì)菌42.9%，真菌44.4%)，這可能與肺活檢組織增加了人源序列的干擾、樣本量小及測序深度有關(guān)。因此，我們也需注意mNGS報(bào)告解讀時(shí)需要綜合考慮標(biāo)本中人源序列的影響、緊密結(jié)合臨床及背景菌群信息等。

綜上所述，臨床應(yīng)用mNGS可顯著提高肺部感染病原學(xué)診斷的敏感性，加強(qiáng)人們對(duì)罕見及新發(fā)現(xiàn)病原菌的認(rèn)識(shí)。在病因不明、抗生素暴露、免疫缺陷等患者的病原學(xué)診斷中具有更高的指導(dǎo)意義，為精準(zhǔn)診療帶來了希望。但是人們也發(fā)現(xiàn)一些存在的問題，比如：難以排除人源序列的干擾、外源微生物污染、DNA/RNA流程不能合并檢測、未優(yōu)化的檢測流程對(duì)檢測周期的影響、測序價(jià)格昂貴等問題一定程度上影響或限制了mNGS在臨床疾病中的應(yīng)用。例如，相對(duì)于無細(xì)胞體液，組織來源的樣本增加了背景菌群，導(dǎo)致微生物測序讀數(shù)的數(shù)量和比例減少，從而降低了mNGS的敏感性[19]。

4 未來臨床應(yīng)用及研究熱點(diǎn)展望

目前將mNGS應(yīng)用于臨床感染性疾病診斷的研究越來越多，其中該技術(shù)在呼吸道疾病中的研究成為新近的研究熱點(diǎn)。新型技術(shù)為克服mNGS的檢測時(shí)效性的技術(shù)瓶頸帶來希望，比如Charalampous等新開發(fā)的針對(duì)細(xì)菌性下呼吸道感染的納米孔測序[20]可以高效移除宿主DNA，并在6h內(nèi)準(zhǔn)確識(shí)別病原體和抗生素抗性基因。除此之外，宏基因組未來發(fā)展還需關(guān)注以下幾個(gè)研究方向：利用RNAseq檢測宿主轉(zhuǎn)錄組評(píng)估臨床感染相關(guān)性、檢測微生物耐藥基因和毒力因子、DNAseq與RNAseq流程合并等。相信不久的將來，隨著宏基因組技術(shù)在臨床感染性疾病應(yīng)用中的不斷深入與發(fā)展，形成一系列規(guī)范操作流程及解讀標(biāo)準(zhǔn)，mNGS將會(huì)成為被廣泛普及的一種病原菌檢測方式，指導(dǎo)臨床醫(yī)師優(yōu)化調(diào)整抗菌藥物，助力解決抗感染治療領(lǐng)域的世界性難題。