頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)茶葉中雪松醇

蔡普默，朱雪芬，查雯雯，馬春華

（武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山354300）

茶是一類健康的非酒精飲料，因其芳香風(fēng)味和具有多種保健功效而廣受歡迎[1]，僅2017年全球茶葉消費(fèi)總量達(dá)544萬噸[2]。茶在我國(guó)已有數(shù)千年歷史，以其加工工藝來區(qū)分，可分為白茶、黑茶、綠茶、紅茶、烏龍茶和黃茶，而不同的茶有著各自獨(dú)特的韻味和香氣特征[3]?，F(xiàn)階段，已從各類茶葉中分離出700余種揮發(fā)性成分，主要含括酯類、醛類、醇類、酮類、雜環(huán)類等[4]。其中，雪松醇又名柏木醇、柏木腦，分子式為C15H26O，屬于倍半萜醇[5]，具有溫和的杉木芳香和持久的柏木香，是茶葉木香香型的重要“呈香”物質(zhì)之一[6]。

香氣是茶葉的靈魂，是茶葉品質(zhì)優(yōu)劣的一個(gè)重要感官評(píng)價(jià)因素，決定茶葉等級(jí)的評(píng)判和價(jià)格的制定，影響消費(fèi)者對(duì)茶葉的喜好程度[7]。茶葉香氣的提取完整度，很大程度上決定了茶葉揮發(fā)性成分的后續(xù)檢測(cè)與分析，其有效提取有助于確認(rèn)茶葉呈香物質(zhì)、研究香氣性能及揭示茶葉香氣形成機(jī)制等[8]。目前，茶葉香氣的常規(guī)檢測(cè)方法是氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9]，樣品前處理的方法有多種，如有機(jī)溶劑萃取法、同時(shí)蒸餾萃?。╯imultaneous distillation and solvent extraction，SDE）[10]、水蒸氣蒸餾（steam distillation，SD）[11]、超臨界 CO2流體萃 取 （supercritical CO2fluid extraction，SFE-CO2）[12]、液-液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）[13]、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）[14]、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）[15]、減壓蒸餾萃取法（vacuum distillation extraction，VDE）[10]、頂空吸附法（headspace analysis，HSA）[16]及溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）[17]等。

SPME法是一種無溶劑、環(huán)境友好型，集合萃取、濃縮和解吸于一體的樣品分析前處理技術(shù)，其在相對(duì)溫和條件下進(jìn)行萃取，避免破壞化合物，與其他萃取方法相比，因具操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、靈敏度高、無溶劑干擾的優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[14]，該方法目前在萃取茶湯香氣和茶葉干茶香的應(yīng)用上較廣[18]。由此可見，SPME和GC-MS技術(shù)的聯(lián)用，將有助于提高分離、定性及定量分析茶葉香氣成分的水平。李云飛等[4]曾通過優(yōu)化SPME萃取條件，并與GC-MS聯(lián)用，建立一套茶葉香氣物質(zhì)——香葉醇的分析測(cè)定方法。

本研究以茶葉為研究對(duì)象，對(duì)萃取纖維類型、萃取溫度、萃取時(shí)間及攪拌速度等萃取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立雪松醇的GC-MS分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

武夷紅茶大紅袍樣品：市售；雪松醇（分析純）、癸酸乙酯（分析純）：美國(guó)Sigama Aldrich公司；乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；RCT磁力攪拌器：德國(guó)IKA公司；ME55/02分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；50/30 μm DVB/微分子篩（Carboxen）/PDMS（DVB/CAR/PDMS）、100 μm PDMS、PA、PDMS/DVB、固相微萃取手柄：美國(guó) Supelco公司；HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm×0.25μm）：美國(guó)Agilent Scientific公司。萃取纖維使用前需根據(jù)說明書對(duì)萃取纖維進(jìn)行老化。

雪松醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取一定量的雪松醇標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇溶解，配制為濃度1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液，再用水稀釋成一系列濃度的工作液，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

基底樣品的制備：將10 g的巖茶葉樣品置于燒杯中，加入75%乙醇溶液浸泡30 min后，洗凈乙醇，用沸水浸泡30 min，多次重復(fù)，直至樣品檢測(cè)不到雪松醇，烘干、粉碎，過40目篩備用。

1.2 方法

1.2.1 固相微萃取

將50 mm的磁子放入裝有5 mL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品萃取液的頂空瓶中，蓋上帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子，將頂空瓶放在磁力攪拌器上水浴加熱；將萃取頭插入樣品瓶中，采用頂空萃取的方式，吸附一段時(shí)間，萃取結(jié)束后進(jìn)樣，于250℃解析5 min。

1.2.2 GC-MS條件

GC條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm×0.25μm）；不分流進(jìn)樣模式，進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速1.0 mL/min；柱流量控制模式：恒壓，49.62 kPa；色譜柱升溫程序：柱溫初始60℃，保持3 min，以3℃/min速率升溫至120℃，保持1 min，再以4℃/min升溫至200℃，保持1 min，最后以5℃/min升溫至240℃，保持1 min。

MS條件：離子源為電子轟擊離子源（electron ionization，EI），電離電壓為70 eV，選擇全離子掃描模式，離子源溫度230℃，四極桿溫度為150℃，接口溫度250℃，輔助加熱器溫度為250℃；溶劑延遲3.0 min。

1.2.3 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

茶葉中的香氣成分雪松醇，受熱后易揮發(fā)，能通過頂空固相微萃取技術(shù)高效提取[19]。然而固相微萃取是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，在應(yīng)用過程中受諸多因素影響，主要有萃取纖維、待測(cè)物濃度、萃取時(shí)間、萃取溫度及攪拌速度等，因此優(yōu)化最適宜的萃取條件顯得十分必要[20]。

萃取纖維：選取 50/30 μm DVB/CAR/PDMS、100 μm PDMS、PA和PDMS/DVB 4種萃取纖維；萃取時(shí)間：選取 10、20、30、40、50 min；萃取溫度：設(shè)置 65、70、75、80、85℃的溫度梯度；攪拌速度：設(shè)定200、300、400、500、600 r/min的攪拌速度。優(yōu)化時(shí)固定其他條件，以某一個(gè)萃取條件為變量，通過測(cè)定不同條件下的目標(biāo)物峰面積，比較不同萃取條件對(duì)萃取雪松醇效率的影響。

1.2.4 方法評(píng)估

吸取20 μL不同濃度的雪松醇標(biāo)準(zhǔn)溶液加到裝有0.05 g空白基質(zhì)的頂空瓶中，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，在優(yōu)化條件下進(jìn)行萃取，后經(jīng)GC-MS分析測(cè)定，以信噪比S/N=3時(shí)雪松醇的濃度作為儀器檢出限（limit of detection，LOD）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品測(cè)定的數(shù)據(jù)為3次重復(fù)測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取纖維的選擇

頂空固相微萃取是待測(cè)物在萃取纖維與待測(cè)樣品之間的富集平衡過程，萃取纖維在一定程度上影響目標(biāo)化合物的吸附量及平衡時(shí)間，通常與待測(cè)物的吸附率呈正相關(guān)，而與平衡時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。依據(jù)“相似相容”原理，可以根據(jù)待測(cè)物的揮發(fā)性和極性，選取與待測(cè)物極性相似的萃取纖維材料，以提高方法精確度[21]，纖維對(duì)雪松醇萃取的影響見圖1。

圖1 纖維對(duì)雪松醇萃取的影響Fig.1 Effects of different fibers on the cedrol extraction

由圖1可知，50/30 μm DVB/CAR/PDMS涂層的萃取纖維對(duì)雪松醇的萃取效率最高，后續(xù)的條件優(yōu)化試驗(yàn)中選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維。

2.1.2 萃取時(shí)間的優(yōu)化

萃取時(shí)間是HS-SPME系統(tǒng)中的一個(gè)重要參數(shù)，受多種因素影響，該系統(tǒng)是待測(cè)物、樣品頂空和萃取纖維之間的三相平衡，整個(gè)過程只要還未達(dá)平衡，待測(cè)液的初始濃度及萃取時(shí)間都會(huì)影響萃取纖維上待測(cè)物的含量[22]，萃取時(shí)間對(duì)雪松醇萃取量的影響見圖2。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)雪松醇萃取量的影響Fig.2 Effects of extraction time on the cedrol extraction

如圖2所示，雪松醇萃取效率隨著時(shí)間的增加都呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在30 min時(shí)達(dá)到高峰，隨著萃取時(shí)間的加長(zhǎng)，萃取效率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)或者基本保持恒定，因此本試驗(yàn)選取30 min。

2.1.3 萃取溫度的優(yōu)化

溶液溫度的升高可以加速分子運(yùn)動(dòng)、提高分子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)能，加速待測(cè)物在各相之間的擴(kuò)散，進(jìn)而有利于萃取。但溫度過高易使物質(zhì)產(chǎn)生高溫反應(yīng)和解吸，因此在萃取過程中應(yīng)確定適宜的萃取溫度，以達(dá)到最佳萃取效果[20]。萃取溫度對(duì)雪松醇萃取量的影響見圖3。

圖3 萃取溫度對(duì)雪松醇萃取量的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on the cedrol extraction

從圖3可以明顯看出80℃時(shí)的萃取效率最高，因此選定80℃為后續(xù)試驗(yàn)的萃取溫度。

2.1.4 攪拌速度的優(yōu)化

待測(cè)物的擴(kuò)散速度會(huì)隨著攪拌速度的提高而加快，這有利于待測(cè)物與萃取纖維之間進(jìn)行傳質(zhì)，最終使體系達(dá)到萃取平衡的時(shí)間縮短，攪拌速度對(duì)雪松醇萃取的影響見圖4。

由圖4可知，隨著攪拌速度的增加，萃取效率先增大，在300 r/min時(shí)達(dá)到最大，之后隨著攪拌速度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此，本試驗(yàn)選擇300 r/min。

2.2 方法評(píng)估

雪松醇檢測(cè)的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限見表1，基底加標(biāo)和樣品的色譜圖見圖5、圖6。

圖4 攪拌速度對(duì)雪松醇萃取的影響Fig.4 Effects of stirring speeds on the cedrol extraction

表1 雪松醇檢測(cè)的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限Table 1 Linear range，correlation coefficient and detection limit of cedrol detection

圖5 茶葉基底加標(biāo)雪松醇色譜圖Fig.5 Chromatogram of cedrol in tea substrate

圖6 茶葉樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of tea sample

如圖5和圖6所示，雪松醇的保留時(shí)間在16.1min，用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜的方法測(cè)雪松醇的含量，方法的線性范圍在 1 μg/kg～200 μg/kg，檢測(cè)限為0.1 μg/kg，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%。

2.3 樣品分析

在最優(yōu)萃取條件下，用該方法檢測(cè)幾種巖茶樣品，標(biāo)號(hào)為1～6，測(cè)定雪松醇的含量，結(jié)果見表2。

表2 茶葉樣品中雪松醇含量分析Table 2 The content analysis of cedrol in tea samples

表2結(jié)果表明，這6種茶葉的雪松醇含量在7.26 μg/kg～28.34μg/kg之間，回收率在81.7%～107.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.9%～6.2%之間。

3 結(jié)論

優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)是提高檢測(cè)靈敏度的重要手段，SPME-GC-MS是一種有效檢測(cè)茶葉香氣成分雪松醇的方法，通過探究SPME纖維、萃取溫度、攪拌速度及萃取時(shí)間等因素，得到茶葉中雪松醇的固相微萃取條件的最優(yōu)方案為：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取涂層的萃取纖維，在萃取溫度為80℃、轉(zhuǎn)速為300 r/min下萃取30 min。在此優(yōu)化的萃取條件下，茶葉中雪松醇平均回收率在81.7%～107.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是3.9%～6.2%，在 1 μg/kg～200 μg/kg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本研究所建立的茶葉中雪松醇的HSSPME-GC-MS分析方法，具有快速、不需要溶劑、靈敏度高等特點(diǎn)，能滿足茶葉中香氣成分雪松醇的檢測(cè)。