一株亞硒酸鈉還原菌的分離及納米硒表征

曾儀維，張小萱，程思俊，劉歡，閔婷，梅運(yùn)軍

(武漢輕工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢，430023)

硒為人體必須的微量元素之一，它在機(jī)體內(nèi)有諸多生物學(xué)功能，如抗氧化、細(xì)胞修復(fù)、增強(qiáng)免疫力以及防癌等[1-3]；人體缺硒會(huì)引起臟器機(jī)能失調(diào)，引發(fā)各種疾病[4-6]。以克山病為例，患者主要表現(xiàn)為急性或慢性心功能不全、心臟擴(kuò)大、心率失常等。調(diào)查顯示，克山病發(fā)生在低硒地區(qū)，患者血液及毛發(fā)中的硒含量明顯低于非病地區(qū)，口服含硒產(chǎn)品能起到預(yù)防克山病的效果，但長期食用含硒量較高的食物會(huì)引起硒慢性中毒。中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)針對(duì)不同人群制定了硒安全攝入量，建議成人硒最高攝入量為400 μg/d，推薦攝入量為50～250 μg/d，兒童為20～50 μg/d，普通癌癥患者為200～400 μg/d[5]。

由于人體不能直接合成硒，通過飲食攝取硒是唯一途徑。不同形態(tài)的硒在人體內(nèi)的吸收、生物效應(yīng)及毒性等也不同。常見的補(bǔ)硒產(chǎn)品大致分為兼具活性與毒性的硒化合物和毒性低的零價(jià)硒。有機(jī)硒類補(bǔ)硒品相對(duì)于無機(jī)硒來說，其生物活性和毒性有很大的改善，但其仍然面臨諸多問題，如生物安全性、生產(chǎn)成本等制約了有機(jī)硒產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)[7]。納米尺寸單質(zhì)硒的出現(xiàn)為硒類產(chǎn)品進(jìn)一步研發(fā)帶來了新的曙光，其主要由化學(xué)法和生物合成法合成。用化學(xué)方法合成的元素硒呈紅色、灰色、褐色或黑色，且顆粒粗大的紅色單質(zhì)硒易聚合轉(zhuǎn)變成灰色或黑色單質(zhì)硒；生物合成納米硒呈紅色膠體狀，這種納米硒是以蛋白質(zhì)為核、紅色單質(zhì)硒為膜和以蛋白質(zhì)為分散劑的納米顆粒[8]。由于化學(xué)方法制備得到的紅色單質(zhì)硒一般粒徑較大，且容易聚合而不穩(wěn)定，人們開始研究控制單質(zhì)硒聚合的方法制備出了納米硒，有研究表明納米硒在100～500 nm有助于植物、動(dòng)物、人類和微生物對(duì)硒的吸收[9]。

研究顯示，微生物細(xì)胞能將硒酸鈉或亞硒酸鈉還原為納米硒[10]。OREMLAND等[11]于2004年利用厭氧菌將有毒性的硒轉(zhuǎn)化成毒性低的納米硒；2010年蔣東華[12]及FESHARAK等[13]分別完成了納米單質(zhì)硒的生物轉(zhuǎn)化。不同微生物還原亞硒酸鈉生成納米硒的粒徑會(huì)有不同，劉紅芳[7]利用乳酸菌LA4將亞硒酸鈉還原為紅色納米的粒徑在50～200 nm；李利軍等[14]利用解淀粉芽孢桿菌Lxz-41合成納米硒的粒徑在300 nm左右。除了利用微生物細(xì)胞合成納米硒外，微生物胞外聚合物也有還原亞硒酸鈉為納米硒的能力[15]。

鑒于納米硒比其他形式的硒具有更高的生物活性和更低的毒性，使其在醫(yī)藥保健品市場上具有更大的吸引力與競爭力，可以預(yù)料，納米硒將具有強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。國外在利用微生物硒還原方面研究較多，而國內(nèi)在這方面研究相對(duì)較少；因此，發(fā)掘更多、更安全的生物納米硒轉(zhuǎn)化菌具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

土樣，2018年4月在湖北恩施州漁塘壩富硒礦區(qū)采集。采集后的土樣用無菌離心管封裝并于4 ℃條件下運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于立即處理。

1.1.2 試劑

酵母抽提物、蛋白胨，OXIOD；瓊脂粉，Biosharp；亞硒酸鈉，Alfa；其他試劑購自國藥集團(tuán)(分析純)。

1.1.3 培養(yǎng)基

亞硒酸鈉還原菌篩選培養(yǎng)基：向LB培養(yǎng)基中添加1 g/L的亞硒酸鈉，制備液體和固體培養(yǎng)基；

亞硒酸鈉耐受性測試培養(yǎng)基：向LB培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉到指定濃度，制備液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

AXIS Ultra DLD X射線光電子能譜儀，日本島津公司；JEOL 7600F掃描電鏡，日本電子公司；FA-45-12-17 eppendorf離心機(jī)，德國艾本德公司；D-1A-50真空冷凍干燥機(jī)，江蘇天翎儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 亞硒酸鈉還原菌的分離純化

取1 g采集的土壤樣品置于含10 mL LB的試管中，用ABSON渦旋儀充分振蕩，轉(zhuǎn)速為2 000 r/min，然后進(jìn)行梯度稀釋。稀釋后的樣品涂布于富集培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后觀察菌落顏色。挑選紅色菌落進(jìn)行復(fù)篩，得到純化的亞硒酸鈉還原菌用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 亞硒酸鈉還原菌對(duì)亞硒酸鈉耐受性分析

取1株上述純化后的亞硒酸鈉還原菌經(jīng)LB液體培養(yǎng)基活化后按2%的接種量接種至相應(yīng)的耐受性測試培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，每天觀察菌體生長與納米硒的生成狀況。

1.3.3 亞硒酸鈉還原菌形態(tài)

經(jīng)LB培養(yǎng)基活化的亞硒酸鈉還原菌離心，按照梁靜南等[16]的方法制備樣品進(jìn)行掃描電鏡測試。

1.3.4 亞硒酸鈉還原菌鑒定

提取活化后亞硒酸鈉還原菌基因組，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rRNA測序；測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)后利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 納米硒的純化及表征

1.3.5.1 納米硒的純化

在含亞硒酸鈉(10 mg/mL)的LB培養(yǎng)基中按照2%的接種量接種新鮮亞硒酸鈉還原菌的培養(yǎng)物，在30 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180 r/min；培養(yǎng)36 h后在6 000×g下離心收集沉淀物。

50 mL培養(yǎng)物形成的沉淀重懸于2 mL的無菌水中，將重懸物移至預(yù)制的蔗糖密度梯度管中(由質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%、60%、70%三個(gè)梯度的蔗糖制備)，8 000×g離心10 min后，收集離心管底部紅色沉淀。

1.3.5.2 納米硒的表征

納米硒掃描電鏡測試：按照1.3.5.1的方法制備的納米硒在冷凍干燥機(jī)上干燥48 h，干燥后的樣品在掃描電鏡上進(jìn)行測試。

納米硒X射線光電子能譜發(fā)(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)分析：按照1.3.5.1方法制備的納米硒在冷凍干燥機(jī)上干燥48 h，干燥后的樣品進(jìn)行XPS分析；不添加亞硒酸鈉的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，離心收集菌體且冷凍干燥后進(jìn)行XPS測試作為對(duì)照。掃描電鏡及XPS分析委托武漢鑠思百檢測技術(shù)有限公司進(jìn)行測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硒酸鈉還原菌的分離純化

樣品土壤重懸并稀釋涂布于亞硒酸鈉還原菌的篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)72 h后挑選紅色單菌落在同樣的培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩，所得結(jié)果如圖1所示。在初篩平板上出現(xiàn)了紅色菌落和白色菌落(圖1-a)，紅色菌落作為亞硒酸鈉還原菌的候選菌株。挑選初篩平板上較大的紅色單菌落重懸后進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩平板上所有菌落呈現(xiàn)紅色且較初篩平板上的菌落顏色深(圖1-b)。從平板篩選的結(jié)果可以看出，純化后的菌落能將亞硒酸鈉還原為紅色產(chǎn)物，該菌作為制備生物活性納米硒的候選菌株。

a-初篩平板; b-復(fù)篩平板圖1 亞硒酸鈉還原菌的分離純化Fig.1 Isolation and purification of selenite reducting bateria

2.2 亞硒酸鈉還原菌對(duì)亞硒酸鈉耐受性分析

挑選復(fù)篩平板上菌落較大的菌株進(jìn)行活化，活化后的納米硒還原菌候選株培養(yǎng)物按照2%的接種量接種到含不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉耐受性測試培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)5 d并觀察，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，0 d，各培養(yǎng)瓶中菌液顏色一致；1 d后，未添加亞硒酸鈉的培養(yǎng)基中菌體生長迅速，培養(yǎng)基明顯渾濁，而添加了亞硒酸鈉的培養(yǎng)基仍然澄清；2 d后，含10 mg/mL亞硒酸鈉的培養(yǎng)瓶中呈現(xiàn)紅色，而亞硒酸鈉其他濃度的培養(yǎng)瓶中無明顯變化；3～4 d后，在10 mg/mL亞硒的培養(yǎng)瓶呈現(xiàn)深紅，其他各濃度的培養(yǎng)物(除0 mg/mL亞硒酸鈉)中略顯紅色，不含亞硒酸鈉添加物的培養(yǎng)物呈現(xiàn)乳白色，為菌體本身顏色； 5 d后，含20 mg/mL亞硒酸鈉的培養(yǎng)瓶呈現(xiàn)暗紅且三角瓶底部有灰色沉淀物，推測灰色沉淀物是由于納米硒顆粒團(tuán)聚造成[8]，而其他各培養(yǎng)瓶較4 d培養(yǎng)物未出現(xiàn)明顯變化。5 d連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為5～10 mg/mL時(shí)菌體生長良好，當(dāng)亞硒酸鈉濃度高于10 mg/mL時(shí)菌體受到抑制，當(dāng)濃度高于20 mg/mL時(shí)菌體幾乎不生長；結(jié)果說明菌株對(duì)亞硒酸鈉的耐受性在10～20 mg/mL，該菌株較現(xiàn)有已報(bào)道的菌株對(duì)亞硒酸鈉有較高的耐受性[12,14, 17-18]，有利于生物制備納米硒。

圖2 亞硒酸鈉還原菌對(duì)亞硒酸鈉耐受性測試Fig.2 Assay of the selenite tolerance by the selenite reducting bacterium

2.3 亞硒酸鈉還原菌形態(tài)

圖3展示了亞硒酸鈉還原菌的菌落形態(tài)及菌體的掃描電鏡結(jié)果。圖3-a顯示亞硒酸鈉還原菌菌落光滑、呈乳白色、易挑起；從掃描電鏡圖(圖3-b)可以看出，亞硒酸鈉還原菌為桿狀菌,形態(tài)均一，長約2 μm，寬約0.8 μm。

a-亞硒酸鈉還原菌菌落; b-亞硒酸鈉還原菌電鏡圖圖3 亞硒酸鈉還原菌菌落及掃描電鏡圖Fig.3 Colonies and scanning electronic microscopy of the selenite reducting baterium

2.4 亞硒酸鈉還原菌鑒定

從生工生物工程(上海)股份有限公司獲得該菌株的16S rRNA序列并提交至GenBank，獲得序列號(hào)為MN853382。利用BLAST軟件進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。圖中標(biāo)記為目的菌株，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(Neighbor-Joining法構(gòu)建)結(jié)果，鑒定為Pseudomonassp.，即本研究分離獲得的菌株為1株具有亞硒酸鈉還原性的假單胞菌屬菌株。

圖4 亞硒酸鈉還原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of the selenite reducting bacterium

2.5 納米硒的純化及表征

2.5.1 納米硒的純化及電鏡表征

按照1.3.5.1的方法對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，培養(yǎng)物中紅色顆粒沉積在離心管底部，微生物細(xì)胞彌散在離心管的中部區(qū)域，呈現(xiàn)乳白色，如圖5-a所示。收集離心管底部的紅色沉淀，冷凍干燥后低溫保存用于后續(xù)分析。

圖5-b為培養(yǎng)物常規(guī)離心收集沉淀物經(jīng)冷凍干燥后的樣品掃描電鏡圖，從圖中可以觀察到培養(yǎng)物中生成的納米硒附著在菌體表面，呈聚集狀，顆粒為球形，粒徑主要分布在100～200 nm，納米硒顆粒粒徑與劉紅芳[7]、王東亮等[19]報(bào)道基本一致；納米顆粒中出現(xiàn)少量團(tuán)聚(圖中白色箭頭所示)，團(tuán)聚體粒徑在500～1 000 nm。圖5-c為培養(yǎng)物常規(guī)離心收集沉淀物后再經(jīng)蔗糖密度梯度離心，收集底部沉淀物冷凍干燥后的樣品掃描電鏡圖，顆粒呈球形，粒徑在100～200 nm；經(jīng)蔗糖密度梯度離心后的產(chǎn)物純度高，未見完整細(xì)胞及細(xì)胞碎片。該結(jié)果表明，蔗糖密度梯度離心適合用于納米硒的分離純化。納米硒粒徑大小在100～500 nm有利于植物、動(dòng)物、人類和微生物對(duì)硒的吸收[8]，因此，本研究中生物轉(zhuǎn)化的納米硒能有較好的生物活性。

a-蔗糖密度梯度離心; b-未梯度離心培養(yǎng)物電鏡圖; c-密度梯度離心后的培養(yǎng)物電鏡圖圖5 納米硒的純化及電鏡圖Fig.5 Purification and SEM of nano-selenium

2.5.2 納米硒的XPS分析

采用XPS測試確定硒元素的價(jià)態(tài)。圖6-a和圖6-b分別為不添加亞硒酸鈉培養(yǎng)的菌體XPS全掃描圖譜及硒元素3d的圖譜，全掃描圖譜和硒元素3d的XPS圖譜中均未出現(xiàn)硒元素的峰，說明樣品中不含硒元素；而純化后的沉淀物的XPS全掃描圖譜(圖6-c)硒元素3d的XPS掃描圖譜(圖6-d)均出現(xiàn)了硒元素的特征電子結(jié)合能峰，且硒元素3d的特征峰值在56.24 eV處。據(jù)劉紅芳[7]、HAN等[20]報(bào)道，單質(zhì)硒的電子束縛能位于54.6～57.5 eV，由此可推斷本研究分離得到的假單胞菌能將亞硒酸鈉中的硒(Ⅳ)轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒。

3 結(jié)論

本研究從湖北省恩施州富硒礦區(qū)的土壤中分離到了1株具有將亞硒酸鈉還原為紅色產(chǎn)物能力的菌株，初步鑒定為假單胞菌(Pseudomonassp.)。通過對(duì)該菌亞硒酸鈉耐受性測試表明，該菌的耐受在10～20 mg/mL；電鏡及XPS分析表明，紅色產(chǎn)物為納米單質(zhì)硒，呈球形，粒徑在100～200 nm；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，蔗糖密度梯度離心為納米硒的分離提供了很好的途徑。該假單胞菌菌株作為生產(chǎn)紅色納米單質(zhì)硒的菌株具有非常好的前景，可為硒的生物轉(zhuǎn)化提供參考。

a-菌體的XPS全掃描圖譜;b-菌體的硒3d XPS掃描圖譜；c-純化后納米硒的XPS全掃描圖譜；d-純化后硒3d的XPS掃描圖譜圖6 納米硒的XPS測試Fig.6 XPS analysis of nano-selenium