快速測(cè)試板在飲用水微生物檢測(cè)中的運(yùn)用

王丹云 黃海民 吉嬈蘭

在現(xiàn)代社會(huì)各個(gè)新型技術(shù)的快速發(fā)展下，微生物快速檢測(cè)技術(shù)開(kāi)始被人們廣泛地應(yīng)用到食品安全監(jiān)測(cè)和微生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。文章在闡述微生物檢測(cè)在水質(zhì)檢測(cè)中應(yīng)用現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，著重分析快速測(cè)試板的應(yīng)用原理，并就快速測(cè)試板在飲用水微生物檢測(cè)中的應(yīng)用方法和應(yīng)用流程問(wèn)題進(jìn)行探究，旨在能夠更好地確保飲用水的安全。

安全的飲用水是居民日常生活的基本需求，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，社會(huì)對(duì)安全的飲水保障愈加關(guān)注和重視，為了滿足對(duì)飲用水中的微生物進(jìn)行監(jiān)控和篩查的需求，微生物快速檢測(cè)技術(shù)開(kāi)始被人們推廣應(yīng)用到水質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域。微生物快速測(cè)試板檢測(cè)方法克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限，并且提高了檢測(cè)效率，縮短了檢測(cè)時(shí)間，為飲用水安全保障監(jiān)管提供了很好的技術(shù)支撐。文章結(jié)合生活飲用水水質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)目發(fā)展實(shí)際情況，就快速測(cè)試板在飲用水微生物檢測(cè)中的具體應(yīng)用進(jìn)行探究。

水質(zhì)檢測(cè)的重要性分析

水是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，從人們生活日常飲用、使用，到工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域都離不開(kāi)水資源，不光是人類，對(duì)于地球生物而言，水也是必不可少的，尤其是與人類生活息息相關(guān)的微生物也是如此。水是微生物生長(zhǎng)和滋生的天然良好培養(yǎng)基，特別是污染的水體中存在大量的有機(jī)物質(zhì)，更適合各種微生物的生長(zhǎng)。水體中的微生物主要來(lái)源于土壤以及人類和動(dòng)物的排泄物及污染，其中的致病性微生物往往是從外界環(huán)境污染而來(lái)，特別是人和其他溫血?jiǎng)游锏募S便污染。飲用水中細(xì)菌一般來(lái)源如下：來(lái)源于水的細(xì)菌有螺旋菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、色桿菌屬、變形桿菌、微球菌等。來(lái)源于土壤的細(xì)菌有芽孢桿菌、鏈球菌、氣單胞菌等。在《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的常規(guī)性微生物指標(biāo)包含總大腸菌群、菌落總數(shù)、大腸埃希氏菌。在對(duì)飲用水中微生物開(kāi)展檢測(cè)的時(shí)候需要確保一系列操作都在無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行，并在檢測(cè)之前對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行殺菌消毒處理，將待檢樣品按標(biāo)準(zhǔn)操作流程接種于特制的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀測(cè)微生物生長(zhǎng)性狀，按標(biāo)準(zhǔn)直接判定或進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)鑒定微生物。

微生物檢測(cè)在水質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

濾膜法。在飲用水中有一群含量比較多的微生物——總大腸菌群。這種微生物廣泛存在水體中。為了能夠有效檢測(cè)總大腸菌群，可以使用濾膜法。即將一定量的水樣注入到薄濾膜器中，在經(jīng)過(guò)一系列的過(guò)濾操作之后將細(xì)菌留在薄膜上，之后將濾膜放在特殊的培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)能夠?qū)颖舅w中的總大腸菌群進(jìn)行計(jì)數(shù)。

多管發(fā)酵法。多管發(fā)酵法的應(yīng)用原理是根據(jù)總大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)生出來(lái)的酸和產(chǎn)氣來(lái)確定水樣中的總大腸菌群。在應(yīng)用多管發(fā)酵方法檢測(cè)水體中微生物的時(shí)候一般會(huì)涉及到以下幾個(gè)步驟：按照標(biāo)準(zhǔn)《GB/ 5750.12-2006 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》針對(duì)出廠自來(lái)水或水源水等水質(zhì)提取一定數(shù)量水樣選擇不同稀釋度接種于乳糖蛋白培養(yǎng)液中，置于36℃正負(fù)1℃培養(yǎng)24小時(shí)正負(fù)2小時(shí)培養(yǎng)后觀察，如若有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即證實(shí)有總大腸菌群存在。根據(jù)總大腸菌群接種管數(shù)，陽(yáng)性管數(shù)等查詢MPN表，既得出100mL水樣中總大腸菌群最可能數(shù)。從實(shí)際操作上來(lái)看，濾膜法適合應(yīng)用在一些雜質(zhì)含量少的水樣中，且操作精準(zhǔn)度比較高。在濾膜方法和多管發(fā)酵方法的綜合作用下能夠提升水質(zhì)檢測(cè)有效性。

PCR技術(shù)。PCR檢測(cè)技術(shù)在使用的時(shí)候可以和其他技術(shù)聯(lián)合使用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)更多微生物的檢測(cè)分析。和一般性的檢測(cè)技術(shù)相比，PCR檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)θ斯o(wú)法培養(yǎng)出來(lái)的微生物和細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。免疫技術(shù)也是一種常見(jiàn)的技術(shù)形式，具體是通過(guò)抗原體反應(yīng)來(lái)檢測(cè)水體中的細(xì)菌含量。不同微生物有著不同的抗原，通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)方式能夠激發(fā)出樣本中的一些元素，從而對(duì)水體中的微生物含量進(jìn)行判斷。在免疫學(xué)技術(shù)應(yīng)用的時(shí)候也可以利用單克隆的抗體來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，這兩種技術(shù)結(jié)合起來(lái)可以更為有效地檢測(cè)出水體中的微生物含量。

快速測(cè)試板的原理和基本操作步驟

原理。微生物快速測(cè)試板是一種提前準(zhǔn)備好一次性培養(yǎng)基產(chǎn)品，產(chǎn)品具備標(biāo)準(zhǔn)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和冷水可溶性吸水凝膠，并在傳統(tǒng)培養(yǎng)基內(nèi)部結(jié)合了酶和底物反應(yīng)的特異性、菌落顏色的可視化信息，能夠在自然的環(huán)境中檢測(cè)和鑒定不同的微生物個(gè)體。

快速檢測(cè)板這種顯色培養(yǎng)基的顯色原理是利用微生物本身代謝產(chǎn)生的酶和對(duì)應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色原理來(lái)檢測(cè)微生物的新型培養(yǎng)基。這些顯色底物具體由產(chǎn)色基因和微生物部分可代謝物質(zhì)組成，在特異性酶的作用下會(huì)將游離出產(chǎn)色基因顏色進(jìn)行顯示，在直接觀察菌落的顏色之后就能夠?qū)N做出判斷?？焖贉y(cè)試板是一種新型分離培養(yǎng)基，借助顯色培養(yǎng)基能夠?qū)Ω鱾€(gè)微生物進(jìn)行篩選分離，且反應(yīng)的靈敏度和特異性要超過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)基，檢測(cè)效果良好，在較短的時(shí)間內(nèi)就能夠完成檢測(cè)。

檢測(cè)步驟?？焖贆z測(cè)板在檢測(cè)操作的時(shí)候節(jié)省了水樣處理、設(shè)備消毒、培養(yǎng)基制作準(zhǔn)備等一系列繁雜的操作步驟，在水樣采集回來(lái)之后將其放置在無(wú)菌的環(huán)境中，微生物測(cè)試板會(huì)被平坦地放置在實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上，掀開(kāi)上面的層膜，應(yīng)用無(wú)菌吸管吸取1ml 的測(cè)試水樣滴落在紙片上，同時(shí)覆蓋上層薄膜，靜靜等待10s之后讓培養(yǎng)基凝固，與此同時(shí)做一片空白陰性對(duì)照。將測(cè)試板疊加在一起放回之前的封袋中并封口處理，處理之后將其透明朝上放置在恒溫的培養(yǎng)箱內(nèi)部，按照所檢測(cè)微生物項(xiàng)目要求的溫度和濕度來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，最后根據(jù)微生物在測(cè)試板上顯示出來(lái)的獨(dú)有顏色和菌落分布情況來(lái)進(jìn)行分析。對(duì)于菌群含有比較少的水樣則可以采取直接吸取原液的方式進(jìn)行測(cè)試。

快速測(cè)試在飲用水微生物檢測(cè)中的具體應(yīng)用

快速測(cè)試板在飲用水菌落總數(shù)檢測(cè)中的應(yīng)用。按照生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方式的基本要求，對(duì)飲用水中菌落總數(shù)的檢測(cè)一般會(huì)應(yīng)用平皿計(jì)數(shù)方式，分別取1mL水樣接種兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板在有氧37℃的環(huán)境中培養(yǎng)兩天，觀察記錄菌落總數(shù)。

基于快速測(cè)試板的菌落測(cè)試方法和國(guó)標(biāo)方法基本一致，測(cè)試總量為1mL，在取樣之前需要在測(cè)試板上涂抹營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并在其中添加脫氧指示劑氯化三苯基四氮唑，菌落在測(cè)試片上會(huì)呈現(xiàn)出紅色，由此能夠縮短計(jì)數(shù)操作時(shí)間。

快速測(cè)試板在飲用水總大腸菌群檢測(cè)中的應(yīng)用?？偞竽c菌群一般是指在置于36℃正負(fù)1℃培養(yǎng)24小時(shí)正負(fù)2小時(shí)培養(yǎng)能夠，發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，兼顧厭氧的革蘭氏陰氏無(wú)芽孢桿菌。生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方式要求的總大腸菌群檢測(cè)方法有三個(gè)，分別是多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法三種類型。自來(lái)水行業(yè)一般會(huì)應(yīng)用濾膜方法，總體大腸菌群測(cè)試板的樣板是酶底物方法。

總大腸菌群濾膜法是指使用孔徑為0.45um的微孔濾膜來(lái)過(guò)濾水樣，過(guò)濾之后將濾膜貼在含有乳糖的品紅亞硫酸鈉選擇性培養(yǎng)基上在37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)正負(fù)2小時(shí)，之后就會(huì)形成特征性菌落。

應(yīng)用這種方式能夠有效測(cè)試出總大腸菌群的數(shù)量，其檢測(cè)結(jié)果十分準(zhǔn)確，但是操作起來(lái)比較復(fù)雜，對(duì)符合特征的菌落還需要進(jìn)行后續(xù)的革蘭氏染色鏡檢查處理，并對(duì)革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽孢桿菌接種乳糖蛋白培養(yǎng)液，之后在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)一整天，如果在這個(gè)過(guò)程中產(chǎn)生了酸氣，則是可以將總大腸菌群判定為陽(yáng)性。

總大腸菌群測(cè)試板使用選擇性培養(yǎng)基，利用總大腸菌群能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化培養(yǎng)基中的色原底物，生成黃色鄰硝基酚，從而使培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化來(lái)檢測(cè)總大腸菌群，和常規(guī)檢測(cè)方法方式相比，快速檢測(cè)板檢測(cè)方式能夠?qū)⒁酝鶑?fù)雜的檢測(cè)步驟進(jìn)行簡(jiǎn)化，檢測(cè)時(shí)間也會(huì)從之前的三天縮短到一天。

快速測(cè)試板在飲用水耐熱大腸菌群檢測(cè)中的應(yīng)用。借助提升培養(yǎng)溫度的方式將自然環(huán)境中的大腸菌群和糞便中大腸菌群區(qū)分檢測(cè)，對(duì)于在44.5℃環(huán)境中仍然能夠生長(zhǎng)的大腸菌群稱作是耐熱大腸菌群。生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)方式推薦的耐熱大腸菌群檢測(cè)方法包含兩個(gè)，分別是多管發(fā)酵法和濾膜法。下面將闡述濾膜法與測(cè)試板法的區(qū)別。

第一，濾膜法。耐熱大腸菌群濾膜法是指應(yīng)用孔徑大小為0.45um的微孔濾膜來(lái)過(guò)濾水樣，在過(guò)濾的過(guò)程中細(xì)菌會(huì)被阻隔在過(guò)濾膜上，過(guò)濾的過(guò)程中將過(guò)濾膜貼在含有乳糖的選擇性培基上，在44.5℃環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)之后能形成特征菌落。耐熱大腸菌群選擇性培養(yǎng)基一般為MFC培養(yǎng)基，耐熱大腸菌群在此基礎(chǔ)上菌落為藍(lán)色，非耐熱大腸菌群菌落一般為灰色或者奶油色，但是在實(shí)際檢測(cè)操作的時(shí)候由于顏色的現(xiàn)實(shí)特異性不強(qiáng)，因此很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的特點(diǎn)。此外對(duì)于可疑菌落還需要進(jìn)行EC的二次培養(yǎng)。

第二，耐熱大腸菌群測(cè)試板。耐熱大腸菌群測(cè)試板是將一定量的乳糖、指示劑、營(yíng)養(yǎng)成分等吸附在一定面積的無(wú)菌過(guò)濾紙上，在細(xì)菌快速繁殖的時(shí)候伴隨產(chǎn)生的酸性物質(zhì)會(huì)讓其酸堿值降低，與此同時(shí)，溴甲酚紫指示劑會(huì)從紫色變成黃色。產(chǎn)氣過(guò)程對(duì)應(yīng)的脫氫酶酸堿值需要被控制在合理的范圍內(nèi)。催化底物脫氫還原TTC形成的紅色不溶性三苯甲臢在產(chǎn)生酸性物質(zhì)的黃色背景下也會(huì)顯示出紅色斑點(diǎn)。通過(guò)指示劑顏色的變化就能對(duì)檢測(cè)樣本是否產(chǎn)生酸性氣體進(jìn)行判斷，進(jìn)而確定是否存在耐熱大腸菌群。

快速測(cè)試板在飲用水大腸埃希氏菌檢測(cè)中的應(yīng)用。大腸埃希氏菌也被人們稱作是大腸桿菌，具備一定的病原性，在一定條件下可對(duì)人、動(dòng)物引起腸胃道或尿道等器官局部組織感染。按照國(guó)家對(duì)生活飲用水的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求，在水樣檢測(cè)出總大腸菌群的時(shí)候需要對(duì)其成分進(jìn)一步檢查，觀察水質(zhì)中是否含有大腸埃希氏菌。

第一，濾膜法檢測(cè)大腸埃希氏菌的常用方式如下：在無(wú)菌操作環(huán)境下將總大腸陽(yáng)性的有典型菌落生長(zhǎng)的濾膜轉(zhuǎn)移到放置NA-MUC培養(yǎng)基平板上，細(xì)菌截留面在上，進(jìn)行36℃的環(huán)境中培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，應(yīng)用波長(zhǎng)為366nm、功率為6W的紫外線等照射樣本，如果菌落邊緣、菌落背部出現(xiàn)了藍(lán)色的熒光物質(zhì)則是說(shuō)明水樣中含有大腸桿菌。

第二，酶底物法。使用選擇性培養(yǎng)基，利用大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化培養(yǎng)基中的色原底物釋放色原體和β-葡萄糖醛酸酶分解熒光底物來(lái)釋放出熒光產(chǎn)物，從而使培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，并能使菌落在紫外燈下產(chǎn)生特征性熒光，以此技術(shù)來(lái)檢測(cè)大腸埃希氏菌。

快速測(cè)試板在飲用水微生物檢測(cè)中的應(yīng)用結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)室從400份的水樣中選擇20份作為基本研究對(duì)象，分別使用國(guó)標(biāo)方法和測(cè)試板方法檢測(cè)樣本中的微生物指標(biāo)。

每個(gè)水樣測(cè)試板方式進(jìn)行五次平行試驗(yàn)檢測(cè)，在對(duì)試驗(yàn)結(jié)果分析之后發(fā)現(xiàn)國(guó)標(biāo)法和測(cè)試板方式的陰性檢測(cè)結(jié)果一致，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果中測(cè)試板方法五次平行試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%。國(guó)際法檢測(cè)微生物所消耗的成本比較低，主要是培養(yǎng)基、濾膜、其他輔助藥品，每個(gè)水樣四個(gè)微生物指標(biāo)耗材成本不高。微生物快速檢測(cè)板作為一次性產(chǎn)品，價(jià)格比較高，且每個(gè)水樣的檢測(cè)費(fèi)用較高。

綜上所述，在居民飲水安全保障日益重視的背景下，飲用水微生物檢測(cè)工作的開(kāi)展變得十分重要。微生物快速測(cè)試板檢測(cè)方式克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方式的局限，在檢測(cè)操作的時(shí)候能夠有效提升飲用水微生物檢測(cè)速率和檢測(cè)精準(zhǔn)性，值得廣泛推廣和應(yīng)用。