金銀花的HPLC指紋圖譜建立及其抗炎作用譜-效關(guān)系研究

繆艷燕 徐幫會 徐劍 張永萍 劉杰 劉耀

摘 要 目的：建立金銀花指紋圖譜，并研究其抗炎作用的譜-效關(guān)系。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）。色譜柱為Diamonsil C18，流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為238 nm，進(jìn)樣量為10 μL。以綠原酸為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》建立10批不同產(chǎn)地金銀花藥材樣品的HPLC指紋圖譜;通過對照品比對，指認(rèn)共有峰對應(yīng)的化學(xué)成分，并進(jìn)行相似度分析。采用二甲苯、角叉菜膠及棉球誘導(dǎo)的急、慢性炎癥小鼠模型評價(jià)10批金銀花藥材水提物對耳、足、肉芽腫的腫脹抑制率，并計(jì)算平均值，作為綜合藥效指標(biāo);基于共有峰峰面積和綜合藥效指標(biāo)，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法（GRA）和偏最小二乘回歸分析法（PLSR）聯(lián)合分析金銀花指紋圖譜與抗炎作用的譜-效關(guān)系，選擇GRA關(guān)聯(lián)度大于0.7且PLSR模型回歸系數(shù)大于0的色譜峰為特征峰，計(jì)算10批金銀花藥材中特征峰峰面積占共有峰峰面積總和的百分比（即“峰占比”）。結(jié)果：10批金銀花藥材樣品的HPLC指紋圖譜中有共有峰25個，相似度為0.775～0.994;指認(rèn)出其中9個成分，分別為蘆?。ǚ?8）、金絲桃苷（峰20）、異綠原酸B（峰22）、木犀草素（峰21）、綠原酸（峰9）、馬錢苷（峰10）、新綠原酸（峰2）、異綠原酸C（峰25）、異綠原酸A（峰23）。10批金銀花對小鼠耳腫脹、足腫脹、肉芽腫均具有抑制作用，抑制率平均值為47.95%～56.52%;GRA分析顯示，關(guān)聯(lián)度由大到小依次為峰8>12>18>16>3>11>20>22>19>21>1>9>10>13>24>14>2>17>25>23>5>4>15，且其關(guān)聯(lián)度均大于0.7;峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24的PLSR模型回歸系數(shù)均大于0，與抗炎作用成正相關(guān);除峰7外，其余均為特征峰，且峰5、8、10、16、18、20、24的變量重要性投影值均大于1。10批金銀花藥材特征峰的峰占比為58.61%～71.19%。結(jié)論：成功建立金銀花的HPLC指紋圖譜，10批樣品組分相似，抗炎成分含量相對較高;暫定金銀花特征峰峰占比不得低于51.8%。

關(guān)鍵詞 金銀花;高效液相色譜法;指紋圖譜;抗炎作用;譜-效關(guān)系;灰色關(guān)聯(lián)度;偏最小二乘法

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）20-2497-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.12

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish fingerprint of Lonicera japonica， and to study its anti-inflammatory spectrum-effect relationship. METHODS： HPLC was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and detection wavelength was 238 nm. The sample size was 10 μL. Using chlorogenic acid as reference， HPLC fingerprint of 10 batches of L. japonica from different production areas was established according to TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition）. By comparing with reference substance， chemical constituents corresponding to common peaks were identified， and the similarity analysis was conducted. Acute and chronic inflammatory models of mice induced by xylene，carrageenan and cotton ball were used to evaluate inhibition rate of 10 batches of L. japonica to ear， foot and granuloma swelling;? the average value was calculated as the comprehensive pharmacodynamic index. The spectrum-effect relationship with HPLC fingerprint of L. japonica and anti-inflammatory effect was analyzed by grey relational analysis （GRA） and partial least squares regressiosn （PLSR） based on common peak area and comprehensive pharmacodynamic index. Chromatographic peaks with correlation>0.7 and regression coefficient of PLSR model>0 were characteristic peaks. The percentage of peak areas of characteristic peaks to peak areas of common peak was calculated in 10 batches of L. japonica （e.g. “peak ratio”）. RESULTS： There were 25 common peaks in HPLC fingerprints of 10 batches of L. japonica， with similarity of 0.775-0.994. Totally 9 peaks were confirmed， i.e. rutin （peak 18）， hyperoside （peak 20）， isochlorogenc acid B （peak 22）， galuteolin （peak 21）， chlorogenc acid （peak 9）， loganin （peak 10）， neochlorogenic acid （peak 2）， isochlorogenic acid C （peak 25）， isochlorogenic acid A （peak 23）. All 10 batches of L. japonica had inhibitory effects on ear swelling， foot swelling and granuloma， with average inhibitory rate of 47.95%-56.52%. The correlation by GRA was peak 8>12>18>16>3>11>20>22>19>21>1>9>10>13>24>14>2>17>25>23>5>4>15， and all of correlations were greater than 0.7. The regression coefficient of PLSR for peaks 2， 4， 5， 7， 8， 10， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 20， 21， 22， 24 were all greater than 0; those peaks were positively correlated with anti-inflammatory effect and were characteristic peaks except for peak 7;? among them， VIP values of peaks 5， 8， 10， 16， 18， 20， 24 were greater than 1. The peak ratio of 10 batches of L. japonica was 58.61%-71.19%. CONCLUSIONS： HPLC fingerprint of 10 batches of L. Japonica is successfully established. 10 batches of samples have similar components， and the content of anti-inflammatory components is relatively high. The proportion of characteristic peaks to common peaks should not be less than 51.8%.

KEYWORDS? ?Lonicera japonica; HPLC; Fingerprint; Anti-inflammatory effect; Spectrum-effect relationship; Grey relational analysis; Partial least squares

金銀花Lonicerae Japonicae Flos為忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或待初開的花，主要分布于我國貴州、河南、山東和湖北等地，其經(jīng)濟(jì)、食用及藥用價(jià)值較高，屬藥食同源植物[1]。金銀花作為藥用歷史悠久的中草藥，具有抗病毒、抗腫瘤、提高免疫和抗氧化等諸多功效[1-2]。目前，已有關(guān)于金銀花指紋圖譜及其抗炎藥效的研究，如劉惠等[3]建立了不同批次金銀花的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，結(jié)果表明，10批金銀花指紋圖譜的相似度均在0.92以上;胡璇等[4]對四倍體金銀花水提物的抗炎作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該水提物具有明顯的抗炎作用。但是，目前尚無研究探討指紋圖譜與抗炎藥效的直接內(nèi)在聯(lián)系[5]?；诖耍狙芯坎捎没疑P(guān)聯(lián)度分析法（GRA）與偏最小二乘回歸分析法（PLSR）聯(lián)合建立金銀花指紋圖譜與抗炎藥效的譜-效關(guān)系，以期從該藥中篩選出與抗炎藥效密切相關(guān)的化學(xué)成分，旨在為金銀花的抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀（美國Agilent公司）;AE240型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];SK8210LHC型超聲波清洗儀（上海商信化玻儀器有限公司）;HHW21.600AⅡ型恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

10批金銀花藥材（編號：S1～S10）經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室孫慶文教授鑒定為忍冬科植物忍冬L. japonica Thunb.的干燥花蕾或待初開的花，其來源信息詳見表1。

1.3 動物

昆明種小鼠，清潔級，雌性，2月齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2014-0011。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 取金銀花藥材適量，粉碎，過40目篩，精密稱取粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加水25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取2 h，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，備用。

2.1.2 對照品溶液 分別精密稱取馬錢苷、木犀草苷、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、新綠原酸、金絲桃苷、蘆丁對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成上述成分質(zhì)量濃度分別為13.2、10.8、7.3、7.1、7.5、7.6、12.8、18、15 μg/mL的單一對照品溶液，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～18 min，7%A→8%A;18～30 min，8%A→12%A;30～50 min，12%A→20%A;50～60 min，20%A;60～65 min，20%A→25%A;65～70 min，25%A→30%A;70～80 min，30%A→7%A）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：238 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.3 指紋圖譜的建立與分析

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批金銀花藥材（編號：S2）適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積。以綠原酸（即峰9，分離度好且峰形對稱）為參照，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，相對保留時(shí)間的RSD均小于1%（n=6），相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批金銀花藥材（編號：S2）適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以綠原酸為參照，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，相對保留時(shí)間的RSD均小于2.5%（n=7），相對峰面積的RSD均小于3%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批金銀花藥材（編號：S2）適量，共6份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以綠原酸峰（峰9）為參照，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，相對保留時(shí)間的RSD均小于1%（n=6），相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 HPLC指紋圖譜的生成 分別取10批金銀花藥材樣品適量，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以S2為參照圖譜（因S2圖譜的色譜峰信號相對較強(qiáng)且峰形明顯），設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 s，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜峰匹配，生成10批金銀花藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜，詳見圖1;采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），詳見圖2。

2.3.5 共有峰指認(rèn) 由圖1和圖2可見，10批金銀花藥材樣品含共有峰25個，通過與對照品（取“2.1.2”項(xiàng)下9種單一對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，其疊加色譜圖見圖3）比對，指認(rèn)出其中9個成分，分別為新綠原酸（峰2）、綠原酸（峰9）、馬錢苷（峰10）、蘆丁（峰18）、金絲桃苷（峰20）、木犀草苷（峰21）、異綠原酸（峰22）、異綠原酸A（峰23）、異綠原酸C（峰25）。

2.3.6 相似度評價(jià) 將10批金銀花藥材樣品的HPLC指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評價(jià)。結(jié)果，10批樣品的相似度在0.775～0.994范圍內(nèi)，詳見表2。

2.4 抗炎作用研究

2.4.1 金銀花水提取液的制備 分別稱取金銀花藥材適量，分別用12、10、10倍量水（mL/g）加熱回流提取3次，每次2 h，合并濾液，濃縮，制成質(zhì)量濃度為0.6 g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液。

2.4.2 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[6]進(jìn)行小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)。將156只小鼠隨機(jī)分成13組，分別為空白對照組、化學(xué)藥陽性對照組（阿司匹林腸溶片，20 mg/kg）、中藥陽性對照組（蒲地藍(lán)消炎片，7.68 mg/g）和10批金銀花組[記為S1～S10組，金銀花水提取液，12 mg/g（以生藥量計(jì)）]，每組12只。化學(xué)藥陽性對照組和中藥陽性對照組給藥劑量按相應(yīng)品種的臨床成人1日劑量計(jì)，S1～S10組給藥劑量按《中國藥典》中金銀花藥材的1日劑量計(jì)。除空白對照組小鼠灌胃等體積生理鹽水外，其余各組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)15 d。末次給藥30 min后，于各組小鼠右耳正反兩面均勻涂抹二甲苯50 μL致炎，并以左耳作為對照。30 min后，將各組小鼠頸椎脫臼處死，用直徑8 mm打孔器在左右耳相對稱部位取耳片，分別稱定質(zhì)量，并按以下公式計(jì)算耳腫脹度和腫脹抑制率：耳腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量，腫脹抑制率=（右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量）/左耳質(zhì)量×100%[7]。采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;計(jì)量資料均以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果，與空白對照組比較，化學(xué)藥陽性對照組、中藥陽性對照組和S1～S10組小鼠耳腫脹度均顯著降低（P<0.01），說明10批金銀花均能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓炎癥腫脹，其中河北獲鹿產(chǎn)金銀花的抗炎作用相對較強(qiáng)（耳腫脹抑制率為49.13%），詳見表3。

2.4.3 小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[6]進(jìn)行小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)。取小鼠156只，按“2.4.2”項(xiàng)下方法分組、給藥。于末次給藥1 h后，在每只小鼠右后足跖部皮內(nèi)注射1%角叉菜膠0.1 mL，分別于注入前及注入后1、2、3、4、6 h測定右后足容積，并按以下公式計(jì)算足腫脹抑制率：足腫脹抑制率（%）=[（空白對照組平均足腫脹度-給藥組平均足腫脹度）/空白對照組平均足腫脹度]×100%[8]。按“2.4.2”項(xiàng)下方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果，10批金銀花對角叉菜膠所致的小鼠足炎癥腫脹均有抑制作用，其中河南新鄉(xiāng)產(chǎn)金銀花的抗炎作用相對較強(qiáng)（足腫脹抑制率為59.86%～79.51%），詳見表4。

2.4.5 抗炎綜合藥效值的確定 由于耳腫脹實(shí)驗(yàn)和足腫脹實(shí)驗(yàn)?zāi)M的是急性炎癥，肉芽腫實(shí)驗(yàn)?zāi)M的是慢性炎癥[10]，因此耳腫脹抑制率、足腫脹抑制率（6 h）和肉芽腫抑制率對評價(jià)抗炎效果具有相同的重要性。因此，基于層次分析法[11-12]賦予上述3個指標(biāo)相同的權(quán)重系數(shù)，以其平均值作為抗炎綜合藥效指標(biāo)，結(jié)果見表6。

2.5 譜-效關(guān)系分析

2.5.1 GRA 以金銀花抗炎綜合藥效作為參考數(shù)列，指紋圖譜中色譜峰的峰面積作為比較數(shù)列，以初值化變換法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理，并計(jì)算GRA的關(guān)聯(lián)度[13]，結(jié)果見表7。由表7可見，金銀花各成分對抗炎效果的貢獻(xiàn)大小依次為：峰8>12>18（蘆?。?16>3>11>20（金絲桃苷）>22（異綠原酸B）>19>21（木犀草素）>1>9（綠原酸）>10（馬錢苷）>13>24>14>2（新綠原酸）>17>25（異綠原酸C）>23（異綠原酸A）>5>4>15，且其關(guān)聯(lián)度均大于0.7，表明金銀花中抗炎成分相對較多，其抗炎作用可能是多組分共同作用的結(jié)果。

2.5.2 PLSR分析 以金銀花指紋圖譜中各共有峰的峰面積為自變量（X），以金銀花抗炎綜合藥效為因變量（Y），采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLSR分析，計(jì)算X對應(yīng)Y的回歸系數(shù)和變量重要性投影（VIP）值，結(jié)果見圖4。由圖4可見，10批金銀花樣品的25個共有峰中，峰2、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24的PLSR模型回歸系數(shù)均大于0，與抗炎效果成正相關(guān)，其中峰5、8、10、16、18、20、24的VIP值>1，表明上述成分對抗炎效果具有顯著影響。

2.6 金銀花藥材質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)的建立

結(jié)合“2.5”項(xiàng)下結(jié)果，選擇同時(shí)滿足GRA中關(guān)聯(lián)度大于0.7和PLSR中與抗炎藥效成正相關(guān)的色譜峰為特征峰（色譜峰2、4、5、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24），其峰面積之和記為Q。結(jié)合藥效數(shù)據(jù)，金銀花Q值越大表明其抗炎作用越強(qiáng)[14]。為避免因儀器、檢測時(shí)間等條件的改變引起色譜峰峰面積的重現(xiàn)性問題所造成的系統(tǒng)誤差，本研究采用“峰占比”（特征峰峰面積占共有峰峰面積總和的百分比來評價(jià)金銀花藥材中具有抗炎作用成分的相對比例，結(jié)果見表8。由表8可見，10批金銀花藥材峰占比的平均值為64.73%，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方法，暫定以峰占比平均值的80%計(jì)為金銀花質(zhì)量評價(jià)的下限，即特征峰峰占比不得低于51.8%[14]。

3 討論

本研究前期分別考察了不同提取方法（超聲、回流）、不同提取溶劑（甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇和水）對金銀花提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以水回流提取2 h的提取率最高。前期還分別考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同流動相（甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液）對色譜峰分離效果的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液、流速為1.0 mL/min時(shí)，相鄰色譜峰的分離效果最好且峰形對稱、無拖尾。

中藥譜效關(guān)系研究是將中藥指紋圖譜（活性物質(zhì)）與藥效學(xué)研究結(jié)合起來，通過合理的譜-效模型和分析方法，系統(tǒng)揭示中藥活性成分與藥理作用之間的關(guān)系[15-16]。GRA是通過灰色關(guān)聯(lián)度來分析和確定系統(tǒng)因素間的影響程度或因素對系統(tǒng)主行為貢獻(xiàn)的一種測試方法，當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.7時(shí)，各共有峰對藥效有一定影響;且關(guān)聯(lián)度越大則影響越強(qiáng)[17]。但GRA結(jié)果只能表達(dá)共有峰對藥效的影響程度，具體是促進(jìn)還是抑制則無法判斷。PLSR在建模過程中集中了主成分分析、典型相關(guān)分析和線性回歸分析方法的特點(diǎn)，通過PLSR模型回歸系數(shù)的正負(fù)來判斷各共有峰對藥效影響的趨勢，即正值為促進(jìn)作用、負(fù)值為抑制作用[18]。因此，將兩種分析方法聯(lián)用，所得同時(shí)滿足關(guān)聯(lián)度大于0.7且PLSR模型回歸系數(shù)為正值的共有峰為特征峰，其對應(yīng)化合物即為對藥效有較強(qiáng)促進(jìn)作用的特征成分。

本研究成功建立了10批金銀花藥材樣品的指紋圖譜，確認(rèn)了25個共有峰，相似度為0.775～0.994，表明此10批金銀花藥材樣品質(zhì)量基本穩(wěn)定，其中個別相似度較低的原因可能與栽培方式、采收加工方法等不同有關(guān)。通過GRA和PLSR分析進(jìn)一步明確了25個共有峰中的17個與抗炎藥效有密切的正相關(guān)性，除峰7外，其余均為特征峰，10批金銀花藥材的峰占比為58.61%～71.19%，暫定特征峰峰占比不得低于51.8%，作為評價(jià)金銀花藥材是否合格的最低限。

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（收稿日期：2020-05-08 修回日期：2020-09-15）

（編輯：鄒麗娟）