匹立尼酸對肝癌TAE 術(shù)后癌旁肝組織過氧化物酶體增殖物激活受體-α、 核因子-κB 和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 表達的影響

范馨予，杜 偉，李正亮，吳春華，楊培鈺，熊文翠

由于過量飲酒、病毒性肝炎和食品安全問題等多種因素共同作用，我國原發(fā)性肝癌發(fā)生率較高。肝癌早期基本無臨床癥狀，臨床發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，我國每年約有 40 萬患者死于肝癌［1］。 經(jīng)導管動脈栓塞術(shù)（transarterial embolization，TAE）具有損傷小、全身不良反應少和術(shù)后爭取傳統(tǒng)手術(shù)切除病灶可能性等優(yōu)點，已在臨床上推廣應用于肝癌治療［2］。但其主要通過切斷腫瘤血供抑制腫瘤生長，故不可避免會對癌旁肝組織生理功能造成不同程度損傷，甚至導致肝臟機能損害［3］，如何減輕TAE 術(shù)后肝功能損傷便成為急需研究的問題。本中心前期研究發(fā)現(xiàn)肝癌TAE 術(shù)后癌旁肝組織中過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）-α 表達下降，核因子（nuclear factor，NF）-κB表達升高，提示癌旁肝組織功能損傷的原因可能與缺血缺氧導致的氧化應激反應和炎性因子過度激活導致的氧化損傷和炎性損傷有關(guān)［4-5］。 匹立尼酸（pirinixic acid，WY14643）是一種人工合成的新型PPAR-α 激動劑，PPAR-α 激活又可與配體結(jié)合，活化轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游基因表達。Zhang 等［6］研究表明PPAR-α 可抑制 NF-κB 啟動子，限制 NF-κB 抑制蛋白（IκB）表達，降低 NF-κB p50、p65 和 Bcl 2 水平，通過直接靶向IκB 和NF-κB 信號通路抑制細胞增殖、誘導癌細胞凋亡，從而抑制腫瘤生長。 Tsai 等［7］研究表明NF-κB 信號通路下游腫瘤進展相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9與肝癌病灶生長、血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，NF-κB信號通路抑制可顯著降低其表達。本研究擬通過觀察給藥后VX2 肝癌模型兔肝臟癌旁組織中PPAR-α、NF-κB 和MMP-9 mRNA 表達判斷匹立尼酸療效和作用機制，以期為優(yōu)化肝癌TAE 治療提供新思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

100 只健康新西蘭大白兔（昆明楚商科技公司，許可證號SCXK-滇K2018-001），體質(zhì)量2.5～3.5 kg，雌雄各半。 2 只VX2 荷瘤兔（東南大學附屬中大醫(yī)院惠贈）用于傳代。

1.2 實驗分組和處理方法

通過傳代和瘤粒注射方式構(gòu)建肝癌兔模型［4-5］，共成功建立65 只經(jīng)典VX2 肝癌兔模型。 根據(jù)隨機數(shù)字表法，從65 只模型兔中選出60 只，隨機分為對照組、TAE 組、聯(lián)合治療組，每組20 只。 對照組：不做任何處理；TAE 組：只行TAE 術(shù)；聯(lián)合治療組：TAE 術(shù)前3 d 連續(xù)耳緣靜脈注射匹立尼酸（美國Sigma 公司）（3 mg·kg-1·d-1），隨后行 TAE 術(shù)。

1.3 TAE 術(shù)

模型兔麻醉后固定于改良操作臺上，備皮、消毒右腹股溝附近10 cm 區(qū)域；于股動脈處切開皮膚，18 G 穿刺針穿刺股動脈，送入3 F 微導管，通過導絲選至腹腔干，再超選至肝總動脈，造影明確腫瘤供血動脈位置；行超選擇性肝左動脈造影，由3 F微導管推入碘化油［劑量=腫瘤直徑（cm）×0.2 mL］，直至腫瘤內(nèi)血流緩慢停滯；術(shù)畢拔管、結(jié)扎股動脈近端并縫合切口。確認模型兔術(shù)后蘇醒并存活3 d，將其處死取肝組織，經(jīng)液氮速凍后存于-80℃冰箱備用。

1.4 模型兔肝功能檢測

術(shù)前3 d 及模型兔處死前分別抽取外周血，分離血清，分裝進Eppendorf 管（EP）做好標記，部分用于檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，部分存于-20℃?zhèn)溆谩?檢測器械為BS-600 型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子公司）、ALT 和AST 試劑盒（上海博耀生物科技公司），通過化學比色法得出ALT、AST 活力值。

1.5 RNA 提取和實時熒光定量聚合酶鏈反應分析

取各組模型兔癌旁適量組織（與癌組織距離＞2 cm 肝組織），0.9%氯化鈉溶液漂洗并做好標記，嚴格按照動物總RNA 快速提取試劑盒（上海捷瑞生物工程公司，貨號GK3016）操作說明，通過TRIzol 法提取總 RNA，測定其光密度（OD）值；根據(jù)OD 值在1.8～2.0 對mRNA 濃度進行統(tǒng)一調(diào)整后，按照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（美國 Thermo 公司，貨號 K1622）和 FastStart Universal SYBR Master 試劑盒（瑞士 Roche 公司，貨號04913 850001）的要求進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。 引物序列見表1。 逆轉(zhuǎn)錄反應條件：42℃孵育50 min，85℃孵育5 min，反應結(jié)束后短暫離心，置于冰上冷卻備用。 擴增條件：①95℃、10 min；②95℃、15 s，60℃、20s，72℃、25 s，40 個循環(huán)；③72℃、10 min。采用相對定量法（2-ΔΔCT法），通過 CFX96 型實時熒光定量聚合酶鏈反應分析儀（美國Bio-Rad Laboratories 公司）分析結(jié)果。

1.6 免疫組化檢測

癌旁組織固定后用石蠟包埋并切片，脫蠟、水化，加入檸檬酸鈉緩沖液修復抗原，用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%羊血清封閉非特異性位點15 min，滴加一抗4℃孵育過夜；磷酸緩沖液（PBS）沖洗，加入二抗37℃孵育30 min；PBS 沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應染色，顯微鏡下觀察顯色清況，流水沖洗結(jié)束顯色；蘇木素復染5 min，流水沖洗，自來水浸洗5 min 返藍，脫水至透明；中性樹膠封片，拍照存檔。

表1 引物序列

由2 名病理醫(yī)師獨立評估結(jié)果，取平均值。 每張切片于400 倍鏡下選取，觀察10 個視野，依據(jù)細胞陽性表達比例和蛋白表達部位陽性信號強度進行綜合評分。 細胞陽性表達比例計分：陽性細胞比例＜5%為 0 分，5%～25%為 1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%為3 分；陽性信號強度計分：細胞無染色為0 分，淡黃色為1 分，黃棕色為2 分，深棕色為3 分。 將細胞陽性評分和陽性信號強度評分之和，作為判定結(jié)果的標準：＜2 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為陽性（++），6～7 分為強陽性（+++），見圖 1、2。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，通過方差齊性檢驗后行單因素方差分析，并兩兩比較；計數(shù)資料以百分率（%）表示，行 χ2檢驗，以 α=0.05 為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 模型兔術(shù)前術(shù)后肝功能檢測

三組模型兔間術(shù)前外周血ALT、AST 水平，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術(shù)后聯(lián)合治療組ALT、AST 水平高于對照組，低于TAE 組，差異均有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表 2。

圖1 PPAR-α 免疫組化信號強度評估圖

圖2 NF-κB 和MMP-9 免疫組化信號強度評估圖

表2 模型兔術(shù)前術(shù)后肝功能檢測比較

2.2 癌旁組織中各基因mRNA 表達

PPAR-α mRNA 在聯(lián)合治療組癌旁組織表達水平（1.83±0.35）顯著高于對照組（1.08±0.12）、TAE 組（1.13±0.07），差異均有統(tǒng)計學意義（圖 3①）；NF-κB mRNA 在聯(lián)合治療組癌旁組織表達水平（1.48±0.28）顯著低于 TAE 組（1.79±0.10），差異有統(tǒng)計學意義，但與對照組（1.34±0.33）比較，差異無統(tǒng)計學意義（圖3②）；MMP-9 mRNA 在聯(lián)合治療組癌旁組織表達水平（1.21±0.36）顯著低于 TAE 組（2.85±0.44），差異有統(tǒng)計學意義，但與對照組（1.07±0.24）比較，差異無統(tǒng)計學意義（圖3③）。

2.3 癌旁組織病理學改變和蛋白免疫組化陽性率

圖3 癌旁組織中各基因mRNA 表達

40 倍光鏡下蘇木精-伊紅染色切片顯示，對照組肝細胞大小一致，排列整齊，圍繞肝小葉中央靜脈呈放射狀分布，肝細胞肝索結(jié)構(gòu)完整；TAE 組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞彌漫大片壞死、崩解，并伴有大量中性粒細胞浸潤；聯(lián)合治療組肝小葉結(jié)構(gòu)部分破壞，部分肝細胞壞死、崩解，并伴少量中性粒細胞浸潤，見圖4。

PPAR-α 在聯(lián)合治療組癌旁組織中陽性率（70%）顯著高于對照組（30%，χ2=6.400，P=0.011）、TAE 組（20%，校正 χ2=8.182，P=0.004），差異均有統(tǒng)計學意義；NF-κB 在聯(lián)合治療組癌旁組織中陽性率（30%）顯著低于 TAE 組（65%，χ2=4.912，P=0.027），差異有統(tǒng)計學意義，但與對照組（20%，校正χ2=0.133，P=0.715）差異無統(tǒng)計學意義；MMP-9 在聯(lián)合治療組癌旁組織中陽性率（35%）顯著低于TAE 組（75%，χ2=6.465，P=0.011），差異有統(tǒng)計學意義，但與對照組（25%，χ2=0.476，P=0.490）差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

圖4 癌旁組織病理學改變

表3 癌旁組織中各蛋白免疫組化陽性結(jié)果

3 討論

TAE 術(shù)中最重要步驟是向腫瘤動脈內(nèi)注射栓塞劑，碘化油栓塞劑可在肝癌病灶內(nèi)沉積，存留2～6 個月。由于肝臟內(nèi)側(cè)支循環(huán)豐富，栓塞劑也會通過側(cè)支循環(huán)擴散至癌旁正常肝組織并沉積，大約2 周后才能被清除，因此栓塞劑可能會導致癌旁正常肝組織缺血缺氧，出現(xiàn)不同程度的炎性反應和細胞損傷。NF-κB 和MMP-9 又與炎性因子釋放密切相關(guān)，術(shù)后癌旁肝組織中的含量會升高［8］。 機體發(fā)生炎性反應時，NF-κB 可調(diào)控其信號通路下游炎性因子腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細胞介素（IL）-10 合成和表達，打破促炎、抗炎平衡，引起靶細胞壞死和組織損傷［9］。MMP-9 除了可增強 IL-8 中性粒細胞趨化活性，其表達量還與腫瘤惡性程度密切相關(guān)［10-11］。MMP-9 可增強腫瘤細胞黏附性、加速正常細胞外基質(zhì)降解、 配合其他酶類損傷癌旁正常組織血管，還可與磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypican，GPC）-3 結(jié)合，促進癌細胞生長，在腫瘤增殖、襲擊和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用［12-13］。有研究表明，跨膜糖蛋白CD147在肝細胞癌中高表達，參與了癌細胞代謝，可通過激活p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路抑制脂肪酸的β-氧化，從而下調(diào)PPAR-α，而PPAR-α下調(diào)加速癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移［14］。 因此，檢測癌旁組織中 PPAR-α、NF-κB 和 MMP-9 表達，可反映手術(shù)治療效果，評估癌旁組織損傷、腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移風險。

本研究結(jié)果顯示TAE 組、 聯(lián)合治療組模型兔ALT、AST 水平顯著高于對照組，提示 TAE 術(shù)確實會對肝功能造成一定程度的影響，這與以往研究結(jié)果相似；而應用了匹立尼酸的聯(lián)合治療組ALT、AST水平又低于TAE 組，提示匹立尼酸一定程度上減輕了TAE 術(shù)對肝臟的損傷，起到保護肝功能的作用。

同時，實時熒光定量聚合酶鏈反應分析結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組癌旁組織中PPAR-α mRNA 表達水平和免疫組化細胞陽性率均顯著高于對照組和TAE 組，提示注射匹立尼酸確實可有效地上調(diào)肝臟癌旁組織中 PPAR-α 表達，這與 Brocker 等［15］在小鼠模型中研究結(jié)果類似，說明匹立尼酸確實可上調(diào)肝臟中PPAR-α 表達；聯(lián)合治療組癌旁組織中NF-κB mRNA 表達水平和免疫組化細胞陽性率顯著低于TAE 組，但與對照組無差異，提示PPAR-α表達上調(diào)可抑制癌旁組織中NF-κB 表達，這與Fang 等［16］在小鼠模型中研究結(jié)果相似；聯(lián)合治療組癌旁組織中MMP-9 mRNA 表達水平和免疫組化細胞陽性率顯著低于TAE 組，但與對照組無差異，提示NF-κB 表達下調(diào)可抑制 NF-κB 信號通路下游MMP-9 表達，這與 Zhu 等［17］、Jiang 等［18］研究結(jié)果相符。 Stomatin 樣蛋白-2 是近年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)線粒體內(nèi)膜蛋白，其在肝癌組織中高表達，沉默其對應基因時可顯著降低NF-κB 和MMP-9 表達，抑制肝癌細胞活力，降低其遷移能力和侵襲能力［17］。 近期有研究表明二甲雙胍和氟西汀作為臨床常用藥物還具有抑制肝癌細胞MMP-9 表達的作用，二甲雙胍可阻斷NF-κB 核易位及其下游基因MMP-9 與uPA 啟動子結(jié)合，氟西汀可通過抑制ERK/NF-κB 表達，降低肝癌細胞抗凋亡能力和侵襲力；此外，二甲雙胍還可增強索拉非尼抗轉(zhuǎn)移作用，因此聯(lián)合應用二甲雙胍、氟西汀等臨床常用藥物是否可增強匹立尼酸抑制NF-κB 信號通路及其下游MMP-9 表達，可作為今后肝癌TAE 術(shù)治療用藥方案的研究方向［19-20］。

綜上所述，本實驗在VX2 肝癌兔模型上驗證了PPAR-α 激動劑匹立尼酸緩解肝癌TAE 術(shù)后癌旁組織炎性反應和肝功能損傷的有效性，其機制可能是匹立尼酸可促進 PPAR-α 表達，抑制 NF-κB 信號通路及其下游MMP-9 表達。 本實驗為肝癌TAE 術(shù)后減輕肝損傷、 保護肝功能提供了新方案和新思路，為改善肝癌患者TAE 術(shù)后生存質(zhì)量提供了新的理論依據(jù)。