Nd: YAG 激光對鈦種植體表面影響的研究

葛琳華，孫夢君，束 蓉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院牙周病科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011

激光是種植體周圍病的治療方式之一，但由于種植體特殊的材質(zhì)和形態(tài)，在應(yīng)用激光進(jìn)行治療時，要考慮其對種植體表面的影響。

摻釹釔鋁石榴石（neodymium-doped: yttrium aluminum garnet，Nd: YAG）激光波長為1 064 nm，有很強(qiáng)的殺菌作用，但也有報道[1]表明Nd: YAG 激光對種植體表面形態(tài)的影響比較明顯。新型Nd: YAG 激光又稱為水霧激光，采用水/汽噴霧冷卻系統(tǒng)，輔助激光工作的同時，在組織表面形成霧狀保護(hù)層，避免因?yàn)榧す獾母邿崃慷鴮?dǎo)致熱損傷。本研究擬觀察新型Nd: YAG 水霧激光對種植體表面形態(tài)和種植體表面成骨細(xì)胞附著的影響，從而評估Nd: YAG 水霧激光治療種植體周圍炎的安全性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將96 個直徑10 mm、厚1 mm 的鈦片進(jìn)行表面處理，其純鈦表面的處理模式包括：機(jī)械研磨拋光（mechanically polished，MP）48 個、噴砂大顆粒酸蝕（sandblasted, large- grit and acid-etched，SLA）48 個。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

將MP 及SLA 鈦片分別隨機(jī)分為3 組：實(shí)驗(yàn)組（Nd: YAG 激光處理組）、對照組[摻鉺鉻釔鈧鎵石榴石激光處理組（erbium, chromium-doped: yttrium scandium gallium garnet，Er, Cr: YSGG）]和空白對照組，每組16 個MP 處理鈦片及16 個SLA 處理鈦片。

1.3 激光處理

1.3.1 Nd: YAG 激光 Nd: YAG 口腔水霧激光治療機(jī)（舒鐳適，中國），波長為1 064 nm。激光參數(shù)：功率1.5 W，水2 氣3，光纖直徑400 μm，非接觸模式，距離1.5 mm。每個鈦片表面只掃描1 次。

1.3.2 Er, Cr: YSGG 激光 Er, Cr: YSGG 水激光口腔治療儀（Biolase，美國），波長2 780 nm。激光參數(shù)：功率1.5 W，頻率20 Hz，模式S，水10%，氣15%，光纖頭MZ6，非接觸模式，距離1.5 mm。每個鈦片表面只掃描1 次。

1.4 鈦片表面形態(tài)觀察

各組取1 個MP 鈦片及1 個SLA 鈦片進(jìn)行干燥，粘臺后行真空純金鍍膜，在掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察鈦片表面形態(tài)，分別放大50 倍、300 倍及1 000 倍，拍攝圖像。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將人骨肉瘤細(xì)胞MG63 培養(yǎng)于含100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合后，采用0.25%胰酶-0.02% EDTA 消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞黏附數(shù)量觀察

將鈦片置于24 孔板中，并以5×104/mL 密度接種MG63 細(xì)胞，每孔1 mL。培養(yǎng)4 h 后，棄去上清，PBS 洗3 次以去除未黏附于鈦片的細(xì)胞，室溫下采用4%多聚甲醛固定已黏附于鈦片上的細(xì)胞30 min，DAPI 染色5 min，熒光顯微鏡下觀察（×100）。每組MP 鈦片及SLA 鈦片各3 個，每個鈦片隨機(jī)選取3 個視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞黏附基因表達(dá)檢測

將鈦片置于24 孔板中，并以1×105/mL 密度接種MG63 細(xì)胞，每孔1 mL。培養(yǎng)4 h 后，棄去上清，PBS洗3 次以去除未黏附于鈦片的細(xì)胞。將鈦片取出置于新的24 孔板中，Trizol 收集黏附于鈦片的細(xì)胞，每組收集MP鈦片及SLA 鈦片各4 個，進(jìn)行后續(xù)RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄及real-time PCR，重復(fù)3 次。引物序列見表1。Real-time PCR 反應(yīng)條件：95℃ 30 s（1 個循環(huán)）；95℃ 5 s，60℃ 30 s（40 個循環(huán)）。

表1 Real-time PCR 引物序列Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以x±s 表示，采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激光處理對鈦片表面形態(tài)的影響

與未經(jīng)激光處理的對照組相比，經(jīng)Nd: YAG 或Er, Cr: YSGG 激光處理后的MP 鈦片（圖1A）與SLA 鈦片（圖 1B），在SEM 下放大50 倍、300 倍、1 000 倍觀察，均未發(fā)現(xiàn)鈦片表面形態(tài)的改變。

2.2 激光處理對鈦片表面細(xì)胞黏附數(shù)量的影響

通過細(xì)胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)激光處理的對照組相比，Nd: YAG 或Er, Cr: YSGG 激光處理MP 鈦片與SLA 鈦片后，4 h 內(nèi)MG63 細(xì)胞在2 種鈦片表面的黏附數(shù)量均未發(fā)生明顯改變（表2），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）（圖2A、2B）。

2.3 激光處理對鈦片表面細(xì)胞黏附基因表達(dá)的影響

通過real-time PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)激光處理的對照組相比，Nd: YAG 或Er, Cr: YSGG 激光處理MP 鈦片與SLA 鈦片后，MG63 在2 種鈦片表面的黏附基因FAK、VCL、FN1、COL1A1 及ITGB1 表達(dá)均未發(fā)生明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表3、圖3）。

圖1 2 種激光處理對鈦片表面形態(tài)影響的SEM 觀察結(jié)果Fig 1 SEM observation of the effect of two laser treatments on the surface morphology of titanium sheets

表2 2 種激光處理后MG63 細(xì)胞在鈦片表面黏附的數(shù)量Tab 2 Number of MG63 cells adhesion on the titanium surface treated by two kinds of laser

圖2 激光處理對MG63 細(xì)胞在鈦片表面黏附數(shù)量的影響Fig 2 Effect of laser treatment on the adhesion quantity of MG63 cells on the surface of titanium sheets

表3 2 種激光處理鈦片表面細(xì)胞黏附基因相對表達(dá)Tab 3 Relative expression of cell adhesion genes on the surface of two laser-treated titanium sheet

圖3 激光處理對鈦片表面細(xì)胞黏附基因表達(dá)的影響Fig 3 Effects of laser treatment on the expression of cell adhesion genes on the surface of titanium sheets

3 討論

激光作為口腔領(lǐng)域的一種治療方法臨床應(yīng)用較廣泛，由于其波長的不同，特性不同，其應(yīng)用范圍、治療效果也各有不同。Nd: YAG 激光是以摻釹釔鋁石榴石晶體為活化介質(zhì)的固體激光器，波長為1 064 nm，水吸收率為0.144，穿透力強(qiáng)，穿透深度可達(dá)1 400 μm，能選擇性吸收黑色素和血紅蛋白，可被含色素的細(xì)菌所吸收，通過光熱效應(yīng)作用于組織，殺菌、凝血效果好。在牙周炎治療方面，Nd: YAG 激光被用于牙周炎的袋內(nèi)清創(chuàng)，去除感染組織。由于不同波長對組織作用深度的不同，Nd: YAG 激光相對來說在牙周袋內(nèi)殺菌作用更強(qiáng)，與傳統(tǒng)牙周治療方法結(jié)合，可取得更好療效。

種植體周圍炎和種植體黏膜炎是種植體的主要并發(fā)癥。種植體周圍炎在臨床上表現(xiàn)為種植體周軟組織炎癥、探診出血、探診深度增大、牙槽骨吸收、種植體松動、種植體周出現(xiàn)透射區(qū), 與牙周炎的臨床表現(xiàn)極為相似。有報道在動物實(shí)驗(yàn)中觀察到無論是天然牙還是種植體周圍齦溝中的微生物變化和牙齦的組織學(xué)變化都很相似。炎癥的產(chǎn)生與種植體周的齦下菌群密切相關(guān)。在發(fā)生種植體周圍炎病損處有牙周可疑致病菌的存在,目前學(xué)者們基本認(rèn)同: 種植體周圍炎和牙周炎均是細(xì)菌感染引起的炎癥性疾病[2]。激光治療種植體周病的研究很多，但激光作用于種植體要注意對種植體表面的影響。在種植體周圍炎的治療中，Nd: YAG 激光有很強(qiáng)的殺菌作用。但也有報道Nd: YAG 激光對種植體表面形態(tài)的影響比較明顯[1,3]。純鈦表面能吸收Nd: YAG 激光，會造成種植體表面熔化、形成凹坑、出現(xiàn)裂紋，而種植體表面結(jié)構(gòu)的變化會影響骨整合。有研究結(jié)果顯示，Nd: YAG 激光參數(shù)設(shè)置不同，對種植體表面影響不同，輸出功率越小，對種植體表面的破壞越小[3]。

激光能量的吸收會產(chǎn)生一系列熱變化，例如：蛋白質(zhì)變性（＞50℃）、蛋白質(zhì)凝結(jié)（＞60℃）、汽化與燒蝕（＞100℃）以及組織碳化（＞200℃）[4]。激光束產(chǎn)生的熱量可能會損壞植入物表面。舒鐳適水霧激光治療機(jī)的水汽霧化冷卻技術(shù)可以輔助激光工作的同時，在組織表面形成霧狀保護(hù)層，避免因?yàn)榧す獾母邿崃慷鴮?dǎo)致熱損傷。舒鐳適水霧激光治療機(jī)相比于傳統(tǒng)Nd: YAG 激光單一脈沖低重頻工作模式，舒鐳適加入高重頻工作端，使熱能不易散發(fā)，累積在治療局域，同時在同步輸出的水霧保護(hù)作用下，用更低的功率就能低風(fēng)險地完成更加高效的治療。舒鐳適水霧激光治療機(jī)用于種植體表面消毒的推薦參數(shù)是功率1.5 W，水2 氣3，光纖直徑400 nm，非接觸模式，距離1.5 mm。

Er, Cr: YSGG 激光，波長為2 780 nm，屬于鉺（erbium，Er）激光家族。Kreisler 等[5]對3 類不同涂層（鈦漿噴涂、酸蝕、羥基磷灰石）的72 個種植體使用Er: YAG 激光（60 ～120 mJ，脈沖型，最大重復(fù)頻率10 Hz）滅菌，發(fā)現(xiàn)即使只是低能量的照射，種植體表面也出現(xiàn)了明顯的滅菌效果。Schwarz 等[6]的一項(xiàng)體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，Er: YAG激光能有效清除殘留的齦下結(jié)石，而沒有任何熱損傷。Er 激光家族在種植體表面的清潔作用是有效和安全的[7]。Azzeh 等[8]在種植體周圍炎手術(shù)治療中使用Er, Cr: YSGG激光（功率1.75 W，頻率20 Hz，MZ6，非接觸模式，距離～5 mm）清創(chuàng)、去肉芽及對種植體表面進(jìn)行消毒，術(shù)中植骨，隨訪18 個月，種植體周圍骨增量效果明顯、穩(wěn)定。 因此，本研究以Er, Cr: YSGG 激光為對照，觀察Nd: YAG 水霧激光對種植體表面的安全性。

Giannini 等[9]的研究中Nd: YAG 激光器在具有適當(dāng)?shù)墓ぷ鲄?shù)（20 mJ，50 或70 Hz）的情況下使用時，能夠在不損壞鈦表面的情況下對有氧和厭氧菌產(chǎn)生一致的微生物消融。李倩等[10]的研究結(jié)果顯示Nd: YAG 激光直接照射種植體表面可引起表面結(jié)構(gòu)明顯變化和周圍組織熱損傷風(fēng)險，采用移動照射操作模式時鈦盤表面結(jié)構(gòu)破壞減弱。本研究中Nd: YAG 激光（功率1.5 W，水2 氣3，光纖直徑400 nm）和Er, Cr: YSGG 激光（功率1.5 W，頻率20 Hz，模式S，水10%，氣15%，光纖頭MZ6）照射采用的參數(shù)都是低能量、非接觸方式，是臨床上適合種植體表面消毒的參數(shù)。經(jīng)過Nd: YAG 或Er, Cr: YSGG 激光移動照射操作模式處理后鈦片SEM 的結(jié)果顯示均未發(fā)現(xiàn)鈦片表面形態(tài)的改變，無裂紋或熔融。

種植體表面骨形成影響因素包括受植區(qū)的生物學(xué)特性和種植體的表面特性。種植體的表面特性是指種植體的表面形態(tài)、表面元素和表面親水性等[11]。Faeda 等[12]在使用Nd: YAG 激光處理種植體表面時發(fā)現(xiàn)種植體表面粗糙度增加，和骨組織的接觸面積增大，有利于骨整合。人成骨肉瘤細(xì)胞株MG63 為一標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株，研究取材方便、表達(dá)穩(wěn)定。本研究以MG63 細(xì)胞為研究對象，通過觀察激光處理后鈦片表面細(xì)胞的黏附數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)激光處理和Er, Cr: YSGG 激光處理的對照組相比，Nd: YAG 激光處理MP 鈦片與SLA 鈦片后，MG63 細(xì)胞在2 種鈦片表面的黏附數(shù)量均未發(fā)生明顯改變。

整合素（integrin）是主要的黏附分子之一，用于介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間的相互識別和黏附。因而，本研究進(jìn)一步檢測了2 種激光處理鈦片表面的黏附基因FAK、VCL、FN1、COL1A1 及ITGB1 的表達(dá)，結(jié)果未見差異。這些基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移、增殖等過程中發(fā)揮重要作用。因此，種植體用Nd: YAG 激光消毒，對種植體表面成骨細(xì)胞的增殖、黏附?jīng)]有影響，不會影響骨整合，但我們的結(jié)果也未顯示激光治療后能促進(jìn)成骨細(xì)胞的附著，可能與激光參數(shù)的設(shè)置有關(guān)，本研究采用的Nd: YAG激光參數(shù)是功率1.5 W，水2 氣3，光纖直徑400 nm，非接觸模式，適用于種植體表面消毒，激光能量較低，從本研究結(jié)果來看，采用這一能量，對種植體表面沒有影響。

新型Nd: YAG 水霧激光沒有熱損傷，在對種植體表面消毒狀態(tài)的較低能量應(yīng)用中未對其表面造成破壞，對種植體表面是安全的，適合于臨床應(yīng)用。但本研究應(yīng)用的激光設(shè)置比較單一，還需對Nd: YAG 水霧激光在種植體治療中的各項(xiàng)參數(shù)做進(jìn)一步研究來明確其安全性。

參·考·文·獻(xiàn)

[1] Romanos GE, Everts H, Nentwig GH. Effects of diode and Nd: YAG laser irradiation on titanium discs: a scanning electron microscope examination[J]. J Periodontol, 2000, 71(5): 810-815.

[2] Buchmann R, Khoury F, Pingel D, et al. The microflora recovered from the outer-surfaces of the Frialit-2 implanto-prosthetic connector[J]. Clin Oral Implant Res, 2003, 14(1): 28-34.

[3] Pick RM, Colvard MD. Current status of lasers in soft tissue dental surgery[J]. J Periodontol, 1993, 64(7): 589-602.

[4] Monteiro L, Delgado ML, Garces F, et al. A histological evaluation of the surgical margins from human oral fibrous-epithelial lesions excised with CO2laser, Diode laser, Er: YAG laser, Nd: YAG laser, electrosurgical scalpel and cold scalpel[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2019, 24(2): e271-e280.

[5] Kreisler M, Kohnen W, Marinello C, et al. Bactericidal effect of the Er: YAG laser on dental implant surfaces: an in vitro study[J]. J Periodontol, 2002, 73(11):1292-1298.

[6] Schwarz F, Rothamel D, Becker J. Influence of an Er: YAG laser on the surface structure of titanium implants[J]. Schweizer Monatsschrift Fur Zahnmedizin,2003, 113(6): 660-671.

[7] Nejem Wakim R, Namour M, Nguyen H, et al. Decontamination of dental implant surfaces by the Er: YAG laser beam: a comparative in vitro study of various protocols[J]. Dent J, 2018, 6(4): 66.

[8] Azzeh MM. Er, Cr: YSGG laser-assisted surgical treatment of peri-implantitis with 1-year reentry and 18-month follow-up[J]. J Periodontol, 2008, 79(10): 2000-2005.

[9] Giannini R, Vassalli M, Chellini F, et al. Neodymium: yttrium aluminum garnet laser irradiation with low pulse energy: a potential tool for the treatment of periimplant disease[J]. Clin Oral Implant Res, 2006, 17(6): 638-643.

[10] 李倩, 孔亞群, Alaxander Franz, 等. Nd: YAG 激光照射對種植體表面結(jié)構(gòu)和溫度的影響研究[J]. 中國實(shí)用口腔科雜志, 2017, 10(6): 360-364.

[11] Schneider GB, Perinpanayagam H, Clegg M, et al. Implant surface roughness affects osteoblast gene expression[J]. J Dent Res, 2003, 82(5): 372-376.

[12] Faeda RS, Tavares HS, Sartori R, et al. Evaluation of titanium implants with surface modification by laser beam: biomechanical study in rabbit tibias[J]. Braz Oral Res, 2009, 23(2): 137-143.