產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR 檢測方法建立

賈鋒軍

（山東省臨朐縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局柳山畜牧獸醫(yī)站 262616）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens,C.P) 又稱魏氏梭菌(Cl.welchii)，首先是Welchii 與Nuttad （1982）由腐敗人尸體的血管中分離到的，并以Welchii 命名[1]。因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖類而產(chǎn)出大量氣體及可以在體內(nèi)能形成莢膜而得名[2]。

PCR 技術(shù)因其簡單、快速、特異性強和靈敏度高的特點，自Mullis1985 年發(fā)明PCR 技術(shù)和Erlich1988 年發(fā)現(xiàn)耐高溫的DNA 聚合酶以來，該技術(shù)以驚人的速度廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，成為當(dāng)代分子生物學(xué)發(fā)展史上的一個里程碑[3]。本試驗應(yīng)用PCR 技術(shù)，通過設(shè)計并合成產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾維氏梭菌和腐敗梭菌的特異性引物，成功擴增出了相應(yīng)目的片段。成功建立起產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾維氏梭菌和腐敗梭菌的PCR 檢測方法。

1 材料

菌株：產(chǎn)氣莢膜梭菌NCTC 528、6212、3180、8346、8084、諾維氏梭菌ATCC 27606、腐敗梭菌ATCC 12464、大腸桿菌、乳酸菌、植物乳酸菌、唾液乳酸菌、枯草芽孢桿菌、遲緩愛德華氏菌、肺炎克雷伯氏菌；以上菌株均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)環(huán)境微生物實驗室保存。

2 方法

2.1 DNA 模板制備

將產(chǎn)氣莢膜梭菌，諾維氏梭菌，腐敗梭菌進行厭氧培養(yǎng)，大腸桿菌進行有氧培養(yǎng)，將所得的菌液水煮10min，12000r/min離心5min，取上清即為所需DNA 模板。

2.2 引物設(shè)計

根據(jù)GeneBank 中已上傳的產(chǎn)氣莢膜梭菌alpha 毒素基因序列，選取alpha 毒素保守區(qū)序列，設(shè)計并合成多對引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所合成引物見附表。

2.3 PCR 擴增反應(yīng)體系

20 ul 反應(yīng)體系：10ul 2×TSINGKE MasterMix （購自青島擎科梓熙生物科技有限公司），8.2ul ddH2O，1ul DNA 模板，0.4ul 上游引物，0.4ul 下游引物。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃延伸30s，72℃復(fù)性30s，35 個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。

2.4 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳與測序

PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取15ul 反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。對產(chǎn)氣莢膜梭菌特異性片段進行切膠并膠回收測序。

2.5 PCR 檢測的特異性、重復(fù)性試驗

產(chǎn)氣莢膜梭菌引物以腐敗梭菌、諾維氏梭菌、大腸桿菌、乳酸菌、植物乳酸菌、唾液乳酸菌、枯草芽孢桿菌、遲緩愛德華氏菌、肺炎克雷伯氏菌為陰性對照，檢測PCR 反應(yīng)的特異性；多次重復(fù)以驗證其重復(fù)性。

2.6 PCR 檢測的臨床應(yīng)用

因產(chǎn)氣莢膜梭菌病臨床樣品較，本實驗用所設(shè)計引物對臨床產(chǎn)氣莢膜梭菌樣品進行PCR 檢測。

3 結(jié)果

3.1 PCR 擴增結(jié)果

利用合成的引物進行PCR 擴增，結(jié)果顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌在85bp （因85bp 和100bp 大小相差很小，圖中顯示在100bp左右）、697bp 處有明顯條帶。所設(shè)計的引物可以擴增出目的片段。擴增結(jié)果如圖1。

3.2 PCR 檢測的特異性、重復(fù)性試驗

在相同情況下，產(chǎn)氣莢膜梭菌的引物只有產(chǎn)氣莢膜梭菌才能擴增出相應(yīng)的片段，諾維氏梭菌的引物只有諾維氏梭菌才可以擴增出相應(yīng)的片段，腐敗梭菌引物只有腐敗梭菌才可以擴增出相應(yīng)的片段，如圖2 顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌 （NCTC 528、6212、3180、8346、8084）在85bp、697bp 處有明顯條帶，腐敗梭菌（ATCC 12464）、諾維氏梭菌（ATCC 27606）在85bp、697bp 處沒有條帶。用乳酸菌、植物乳酸菌、唾液乳酸菌、枯草芽孢桿菌、遲緩愛德華氏菌、肺炎克雷伯氏菌分別對所設(shè)計的引物進行PCR 擴增，如圖3 所示，均未擴增出條帶。重復(fù)性試驗顯示，多次重復(fù)均可擴增出相應(yīng)目的條帶。綜上，所設(shè)計的引物特異性好、重復(fù)性好。

附表 引物合成表

圖1 PCR 擴增結(jié)果電泳圖

圖2 PCR 擴增結(jié)果電泳圖

3.3 PCR 檢測的臨床應(yīng)用

在獲得天然感染產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性樣品，對其進行PCR 鑒定。結(jié)果顯示，所設(shè)計的產(chǎn)氣莢膜梭菌可以擴增出目的片段，如圖4。所建立的PCR 可檢測出陽性臨床樣品。

4 討論

圖3 PCR 擴增結(jié)果電泳圖

圖4 PCR 擴增結(jié)果電泳圖

梭菌屬（Clostridium）的細菌是一群可形成芽孢，且芽孢普遍大于菌體，致使菌型從桿狀變?yōu)樗鬆畹囊活惛锾m氏陽性厭氧大腸桿菌。這屬細菌有許多共同的特點：分布極其廣泛，存在于腐物、土壤、人和動物腸道中，多數(shù)為腐物寄生菌，只有少數(shù)為致病菌。在致病菌的致病力上，本屬菌多通過外傷感染，多數(shù)是通過細菌產(chǎn)生的外毒素致病，其中第1 種類型細菌侵入動物機體，與其所產(chǎn)生的毒素共同引起相應(yīng)的疾病，如產(chǎn)氣莢膜梭菌、水腫梭菌（諾維氏梭菌）、腐敗梭菌、溶組織梭菌等；第2 種類型菌體雖然在機體內(nèi)生長繁殖，但只有其所產(chǎn)生的毒素致病，菌體的直接致病作用很小，如破傷風(fēng)梭菌；第3 種類型菌體并不侵入機體，但可在體外產(chǎn)生毒素，人和動物是由于攝取了被毒素污染的食物或飼料引起中毒性疾病，因此，對此類疾病的微生物學(xué)診斷既要進行細菌學(xué)檢查，又要進行毒素檢測，后者更為重要。腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌易于動物死亡后侵入機體，諾維氏梭菌，溶血梭菌，腐敗梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌等則存在于正常動物體中，由動物體內(nèi)分離出這些梭菌，并不能肯定它們就是病原菌，應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)，病變及微生物學(xué)檢查等綜合判斷。此時，細菌的毒力測定極為重要[4]。

α 毒素是A、B、C、D、E 型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生的外毒素[5]，其中，A 型菌的α 毒素產(chǎn)量最高。目前，國內(nèi)已構(gòu)建了針對該菌α 毒素的雙夾心ELISA 方法用來檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌[6]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌α 毒素引起的疾病大多發(fā)病急、死亡快，缺乏有效的治療途徑。因此，提前進行預(yù)防，早日確診對動物診療顯得尤為重要。截止到目前，產(chǎn)氣莢膜梭菌α 毒素的檢測方法研究已經(jīng)相當(dāng)成熟，同時也獲得了很好的科研成果。就目前而言，檢測α 毒素的主要方法有各種類型的ELISA 方法、膠體金試紙條法、免疫印跡的方法[7]等。

本文選用產(chǎn)氣莢膜梭菌的α 毒素部分基因片段進行基因擴增來達到對其鑒定的目的。文中所建立的PCR 檢測方法是可行的，可以作為產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測技術(shù)及其所致疾病的診斷方法。