基于NGF-TrkA通路研究電針療法治療糞失禁兔動(dòng)物模型的作用機(jī)制*

王曉鋒，崔國(guó)策，李宇飛，何穎華，智建文，周嬌嬌，李嘉俊,李華山

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院,北京 100053)

大便失禁即肛門失禁，為排便功能紊亂的一種癥狀，雖不直接威脅生命，但嚴(yán)重干擾患者正常工作和生活，給患者造成生理和心理上的痛苦[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示肛門失禁發(fā)生率在1.4%～18%，而在養(yǎng)老院人群中可達(dá)50%[2]。隨著我國(guó)人口老齡化加劇，肛門失禁發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，對(duì)人類健康造成極大威脅。電針療法是針灸與電刺激兩者結(jié)合的綜合方法，具有針對(duì)性強(qiáng)、適應(yīng)證廣、安全性高和醫(yī)療成本低的特點(diǎn)，社會(huì)反應(yīng)普遍較好[3]。既往研究報(bào)道電針療法對(duì)大便失禁有一定改善作用[4]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor，NGF)是一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化、生長(zhǎng)的作用[5]。酪氨酸激酶受體A(Tyrosine kinase receptor A，TrkA)是NGF的特異性高親和力受體，介導(dǎo)NGF大多數(shù)生物功能[6]。有研究顯示NGF-TrkA信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)病變發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)大便失禁的基礎(chǔ)研究較少，電針療法對(duì)大便失禁的具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究基于NGF-TrkA通路研究電針療法治療糞失禁兔動(dòng)物模型的作用機(jī)制，以期為臨床治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和進(jìn)一步研究線索，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

新西蘭兔30只，SPF級(jí)，雄性，8月齡，購(gòu)于深圳康泰生物制品股份有限公司[生產(chǎn)許可SYXK(粵)2018-0193]。將30只新西蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組10只。

1.2 糞失禁兔動(dòng)物模型制備

取模型組和治療組新西蘭兔，按30 mL/kg耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司)予以麻醉，麻醉成功后固定實(shí)驗(yàn)兔，骶尾部剃毛，常規(guī)消毒，取Kimberly-Clark專用穿刺針(上海愛澤工業(yè)設(shè)備有限公司)于第4薦神經(jīng)的解剖部位穿刺，穿刺到位后將穿刺針針芯更換射頻針針芯，選擇射頻治療儀(加拿大Baylis公司，型號(hào)：PMG-230)按鍵中的CURRENT鍵，增大電流直至實(shí)驗(yàn)兔肛門出現(xiàn)抽搐、收縮，觀察電流值0.6～1.0 mA時(shí)開啟熱凝射頻治療模式(時(shí)間設(shè)定：90 s，溫度設(shè)定：85℃)，開始射頻能量傳輸，操作完成后，待射頻針溫度<40℃時(shí)再次傳輸射頻能量。術(shù)后14 d時(shí)測(cè)定肛門靜息壓<15 mmHg即為造模成功。

1.3 干預(yù)方法

造模成功后，對(duì)照組和模型組不作任何干預(yù)，治療組采用電針治療。電針治療步驟：針刺雙側(cè)中髎(骶部髂后上棘內(nèi)下方，第3骶后孔處，直刺15 mm)、單側(cè)三陰交(后肢內(nèi)踝尖直上方3 cm處，直刺2 mm)、單側(cè)足三里(后肢膝關(guān)節(jié)前處稍下方，腓骨小頭下2.5 cm，直刺10 mm)，針刺后連接電針治療儀(廣州市美強(qiáng)醫(yī)療科技有限公司，型號(hào)：XS-998B)，雙側(cè)中髎一組，三陰交與足三里一組。刺激參數(shù)：持續(xù)波，頻率10 Hz，脈寬200 μs，取穴為同一側(cè)。隔日治療1次，每次20 min，連續(xù)治療3個(gè)月。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 肛門靜息壓 于治療結(jié)束測(cè)定各組新西蘭兔肛門靜息壓，操作如下：固定各組新西蘭兔，打開消化道動(dòng)力測(cè)定儀(廣州市瑞橋貿(mào)易有限公司，型號(hào)：XDJ-S8G)，初始化完成后測(cè)壓管道注水、調(diào)零，實(shí)驗(yàn)兔肛門內(nèi)插入測(cè)壓管3 cm，按下“取值鍵”讀取數(shù)值，緩慢退出測(cè)壓管，每隔1 cm讀取數(shù)值，共讀取3次，取平均值。

1.4.2 肛門括約肌組織形態(tài)學(xué)變化 各組新西蘭兔肛門靜息壓測(cè)定完成后，處死5只，取其肛門括約肌組織，用10%甲醛溶液(上海鈺博生物科技有限公司)固定，梯度酒精(北京宏昌信科技有限公司)脫水，二甲苯(上海麥克林生化科技有限公司)透明，石蠟包埋成塊，采用組織切片機(jī)(上海精密儀器儀表有限公司，型號(hào)：McIlwain)切成5 μm連續(xù)切片，脫蠟水化，采用HE染色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)染色，流水沖洗，烘片0.5 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠固封劑(天津百倫斯生物技術(shù)有限公司)封片，采用光學(xué)顯微鏡(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，型號(hào)：SH11/YF-9)觀察HE染色結(jié)果。

1.4.3 肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量 HE染色完成后，處死剩余5只新西蘭兔，取其肛門括約肌組織，剪碎，加RIPA裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，置于組織勻漿器(北京海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司)中，10 000 rpm離心5 min，取上清，使用BCA試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，選擇濕轉(zhuǎn)，TBS-T 25℃封閉1 h，加入NGF一抗(1∶500)(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司)、TrkA一抗(1∶300)(湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司)、GAPDH一抗(1∶400)(深圳欣博盛生物科技有限公司)，4℃搖床過夜，PBST洗膜，加二抗(1∶2 000)(武漢愛博泰克生物科技有限公司)，4℃搖床過夜，PBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒(上海碩嘉生物科技有限公司)顯色、顯影，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，用Image Quant TL軟件分析各條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組新西蘭兔肛門靜息壓比較

模型組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組新西蘭兔肛門靜息壓比較

2.2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肌纖維連續(xù)完整，括約肌厚度、固有層厚度、肌纖維數(shù)量均正常；模型組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，括約肌全層變薄，固有層結(jié)締組織變厚，肌纖維數(shù)量明顯減少、變細(xì)、斷裂，橫紋肌致密程度明顯下降；治療組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善，括約肌全層變厚，固有層結(jié)締組織變薄，肌纖維變粗并趨于完整，肌纖維數(shù)量增多，橫紋肌致密程度增加。見圖1。

注：A為對(duì)照組，B為模型組，C為治療組。圖1 各組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，100×)

2.3 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量比較

模型組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量比較

圖2 各組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量

3 討論

大便失禁是指肛門括約肌對(duì)氣體及糞便控制能力減弱或消失，糞便不自主地排泄，至少持續(xù)3個(gè)月。長(zhǎng)期大便失禁會(huì)使肛周皮膚受溢出糞便反復(fù)刺激，使皮膚處于潮濕和代謝產(chǎn)物侵蝕狀態(tài)，造成壓力性潰瘍、會(huì)陰部皮炎和骶尾部皮炎等，嚴(yán)重影響患者健康水平與生活質(zhì)量。大便失禁常見病因包括肛門直腸畸形、解剖結(jié)構(gòu)損傷(結(jié)腸肛管吻合術(shù)、低位前切除術(shù)等)、神經(jīng)系統(tǒng)病變(腦梗死、脊髓結(jié)核和運(yùn)動(dòng)性共濟(jì)失調(diào)等)、直腸平滑肌病變和糞便成分異常(腸易激綜合征、感染性腹瀉)等[8]。目前大便失禁治療方法繁多，治療效果尚不確切，作用機(jī)制仍不清楚，因此有必要開展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，為大便失禁發(fā)生機(jī)理和臨床治療奠定基礎(chǔ)。

電刺激療法是采用低頻脈沖電刺激脊髓神經(jīng)，使患者恢復(fù)身體機(jī)能，有效提高生活質(zhì)量。近年來電刺激療法已廣泛應(yīng)用于癱瘓、脊柱側(cè)凸和胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease，GERD)等疾病[9-11]。針灸是我國(guó)特有的治療疾病的手段，為中醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要組成部分，主要通過經(jīng)絡(luò)、腧穴的傳導(dǎo)作用達(dá)到治療全身疾病目的，其作為補(bǔ)充和替代療法在西方國(guó)家也吸引了越來越多的關(guān)注[12]。電針療法是針灸與電刺激兩者結(jié)合的綜合方法，具有針對(duì)性強(qiáng)、適應(yīng)證廣、安全性高和醫(yī)療成本低的特點(diǎn)。有研究證實(shí)電針療法具有興奮性和抑制性的雙向調(diào)節(jié)作用，可通過促進(jìn)肛門括約肌收縮改善機(jī)體排便功能[13]。中醫(yī)臨床實(shí)踐證實(shí)電針療法對(duì)脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)后神經(jīng)源性膀胱有確切療效[14]。本研究選擇主治大小便不利的中髎、三陰交、足三里3個(gè)穴位進(jìn)行電針治療，發(fā)現(xiàn)模型組新西蘭兔肛門靜息壓顯著低于對(duì)照組，治療組新西蘭兔肛門靜息壓顯著高于模型組，這與既往研究報(bào)道一致，提示電針療法對(duì)大便失禁有一定改善作用[4]。本研究HE染色顯示治療組新西蘭兔肛門括約肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善，括約肌全層變厚，固有層結(jié)締組織變薄，肌纖維變粗并趨于完整，肌纖維數(shù)量增多，橫紋肌致密程度增加，由此提示電針療法可有效改善大便失禁實(shí)驗(yàn)兔肛門括約肌組織病理改變。NGF是一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能，并在中樞及周圍神經(jīng)元發(fā)育、分化、生長(zhǎng)和再生過程中有重要的調(diào)控作用。此外NGF還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，抑制腫瘤有絲分裂，促進(jìn)創(chuàng)口組織修復(fù)反應(yīng)。酪氨酸激酶受體(Tyrosine kinase receptor，Trk)由細(xì)胞外、跨膜及細(xì)胞內(nèi)三部分組成，具有酪氨酸蛋白激酶活性，其可使位于膜內(nèi)區(qū)段上的酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase，TPK)激活，使自身肽鏈和膜內(nèi)蛋白底物中的酪氨酸殘基(Tyrosine residue，PTYR)磷酸化，從而將細(xì)胞內(nèi)信息傳遞到細(xì)胞外，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄過程改變及細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。TrkA是NGF的特異性高親和力受體，能夠介導(dǎo)NGF一系列生物學(xué)效應(yīng)[15]。相關(guān)研究表明NGF-Trk A信號(hào)通路與腫瘤增殖、血管生成和神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[16]。既往研究顯示電針可以促進(jìn)腦缺血損傷大鼠海馬組織中TrkA表達(dá)，從而減少腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[17]。本研究顯示模型組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，治療組新西蘭兔肛門括約肌組織中NGF、TrkA蛋白表達(dá)量顯著高于模型組，電針療法可能通過激活NGF-TrkA信號(hào)通路對(duì)糞失禁兔動(dòng)物模型起到改善作用，這可為臨床大便失禁的治療提供新的思路。

綜上所述，電針療法可能通過激活NGF-TrkA信號(hào)通路對(duì)糞失禁兔動(dòng)物模型起到改善作用，這可為臨床治療大便失禁提供理論依據(jù)。但本研究時(shí)間較短，仍有待進(jìn)一步研究。