2株毛竹枯梢病拮抗細(xì)菌篩選及其促生功能

楊 豆，王清海，萬(wàn)松澤，李 麗，張 揚(yáng)＊

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局鄱陽(yáng)湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2. 山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014)

毛竹（Phyllostachys edulis(Carrière) J. Houz.）隸屬禾本科剛竹屬單軸散生竹，在竹類植物中具有用途最廣泛、經(jīng)營(yíng)周期較短且經(jīng)濟(jì)效益較高的特點(diǎn)，已成為我國(guó)南方農(nóng)林產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、林業(yè)增效、林農(nóng)增收的主要經(jīng)濟(jì)林種[1]。我國(guó)現(xiàn)有毛竹林面積380多萬(wàn)公頃，占全國(guó)竹林面積的70%，占全世界毛竹面積的80%[1-2]。自毛竹枯梢病在浙江黃巖首次發(fā)現(xiàn)后，相繼在南方各省份爆發(fā)成災(zāi)，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，極大程度地制約了我國(guó)毛竹資源培育和竹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該病害病原菌為竹喙球菌（Ceratosphaeria phyllostachydis），主要危害當(dāng)年生新竹，造成枯株?duì)顟B(tài)，已被列為國(guó)家森林植物檢疫對(duì)象[3-5]。磷是植物生長(zhǎng)過程中僅次于氮的第二大限制營(yíng)養(yǎng)元素，約占植物干質(zhì)量的0.2%[6]，在生態(tài)系統(tǒng)能量代謝、核酸和蛋白質(zhì)合成以及激酶調(diào)控等方面發(fā)揮著不可替代的作用[7]。由于土壤中僅有約0.1%的磷能直接被植物吸收利用，其余主要以難溶性磷酸鹽存在[8]。因此，人們通過施用大量磷肥來滿足植物對(duì)于磷素的需求，然而磷肥中的磷酸根離子極易與土壤中游離的Ca2+、Fe3+和Al3+等離子發(fā)生鰲合作用形成難溶性磷酸鹽，導(dǎo)致施用磷肥中僅有5%～25%可被植物吸收利用，大量殘余部分造成土壤磷素富集和土壤肥力喪失[9]，引發(fā)了一系列的環(huán)境問題。這些亟待解決的問題使得提高毛竹抗病能力和竹林土壤磷素有效性成為一種迫切需要。

植物體內(nèi)分布著豐富的有益內(nèi)生細(xì)菌，它們不但可以通過分泌IAA、利用解磷和固氮等功能直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，還可通過分泌抗生素、水解酶等物質(zhì)來幫助寄主植物提高抗病性，改善植物健康[10]。研究表明，多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌不僅存在于植物體內(nèi)，也常存活于植物根際土壤環(huán)境中[11-12]。由于從土壤中篩選出的促生細(xì)菌在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，其在定殖過程中易受土著微生物的干擾導(dǎo)致定殖成功率不高、應(yīng)用效果較實(shí)驗(yàn)結(jié)果欠佳[13]。因此，利用內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行植物病害防治和促生方面的應(yīng)用已成為近年來的研究熱點(diǎn)。然而目前關(guān)于毛竹內(nèi)生細(xì)菌的相關(guān)研究仍較少，且對(duì)毛竹內(nèi)生細(xì)菌抗病促生方面的研究也尚未見報(bào)道。故本試驗(yàn)對(duì)毛竹根系內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，以竹喙球菌（C. phyllostachydis）作為指示菌進(jìn)行拮抗菌株篩選，測(cè)定優(yōu)良內(nèi)生拮抗細(xì)菌的解磷能力和IAA等指標(biāo)并進(jìn)行種類鑒定。通過溫室盆栽接種試驗(yàn)檢驗(yàn)其對(duì)毛竹實(shí)生苗的促生長(zhǎng)作用，以期為增強(qiáng)毛竹抗枯梢病能力，改善毛竹林地土壤養(yǎng)分情況，提高竹林生產(chǎn)力提供一條有效的生物途徑，也為制備保護(hù)竹林健康及提高竹林生產(chǎn)力相關(guān)微生物菌劑提供優(yōu)良的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 毛竹枯稍病病原菌竹喙球菌（C.phyllostachydis）由中國(guó)林業(yè)微生物菌種保藏中心贈(zèng)送，現(xiàn)保存于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局鄱陽(yáng)湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基種類 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，瓊脂16 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.2。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB）：NA培養(yǎng)基不加瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂18 g，水1 000 mL。

磷酸鹽生長(zhǎng)培養(yǎng)基（NBRIP）：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.1 g，KCl 0.2 g，MgCl25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，Ca3(PO4)25 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

含溴酚藍(lán)的磷酸鹽生長(zhǎng)培養(yǎng)基（NBRI-BPB）：在NBRIP培養(yǎng)基中加溴酚藍(lán)（0.025 g·L-1）。

1.1.3 樣品采集 樣品分別采集于江西省官山林場(chǎng)、大井林場(chǎng)和大港林場(chǎng)毛竹林地，選取4～5年生毛竹，挖出根系，取部分細(xì)根裝入無菌自封袋中，標(biāo)明采樣點(diǎn)、時(shí)間、編號(hào)等，置于4℃冰箱冷藏室備用。

1.2 方法

1.2.1 毛竹根系內(nèi)生細(xì)菌的分離 毛竹根系用蒸餾水沖洗3遍，按下述步驟進(jìn)行表面消毒：75% 酒精浸泡1 min，3.25%次氯酸鈉浸泡3 min，75%酒精浸泡30 s，后用無菌水沖洗3遍，無菌濾紙吸干表面水分，進(jìn)行研磨，收集研磨液[14]。用最后一次沖洗后的無菌水涂布NA平板，檢驗(yàn)是否表面滅菌徹底。采用稀釋平板法[15]，將純化的單菌落于NA斜面培養(yǎng)、儲(chǔ)存、備用。

1.2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選 將培養(yǎng)5 d后的竹喙球菌菌餅放置在PDA平板中央，將分離所得的細(xì)菌采用劃線法接種于PDA平板兩側(cè)，設(shè)置僅接病原菌的PDA平板為對(duì)照，各處理3個(gè)重復(fù)。置28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4 d后測(cè)量抑菌帶寬度并做標(biāo)記。將抑菌效果較好的菌株P(guān)N1和PN6接種于NB培養(yǎng)基中。用150 mL搖瓶進(jìn)行發(fā)酵液培養(yǎng)，每瓶裝液量50 mL，于30℃（200 r·min-1）培養(yǎng)2 d。將培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾?；旌? mL無菌濾液與20 mL PDA培養(yǎng)基后倒平板；以等量無菌水代替無菌濾液為對(duì)照，接竹喙球菌菌塊于平板中央培養(yǎng)4 d（28℃），各處理3個(gè)重復(fù)。測(cè)量并計(jì)算各處理生長(zhǎng)抑菌率。計(jì)算公式如下：

1.2.3 內(nèi)生拮抗細(xì)菌PN1和PN6生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 采用比濁法測(cè)定菌株P(guān)N1和PN6的生長(zhǎng)曲線，將菌株P(guān)N1和PN6在NB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，每隔6個(gè)小時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌PN1和PN6解磷能力的測(cè)定 采用Pikovskaya等人的方法對(duì)菌株P(guān)N1和PN6進(jìn)行解磷能力的定量測(cè)定。將菌株P(guān)N1和PN6在NB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)24 h，配制菌液濃度為1×108cfu·mL-1后，將菌液按1%的接種量至50 mL NBRIP培養(yǎng)液中，以等體積未接菌NBRIP培養(yǎng)液為對(duì)照，置于30℃、180 r·min-1環(huán)境下?lián)u培5 d，各處理5個(gè)重復(fù)。將發(fā)酵液于4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，取各處理上清液采用鉬銻抗比色法測(cè)其可溶性磷含量[16]。

1.2.5 內(nèi)生拮抗細(xì)菌PN1和PN6分泌IAA能力測(cè)定 菌株產(chǎn)IAA量采用Salkowski比色法測(cè)定。將IAA標(biāo)樣稀釋至0，0.5，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15，17.5，25，50 mg·L-1，將各濃度梯度的IAA與FeCl3比色液等比例混合（2 mL）在30℃下暗儲(chǔ)藏30 min后，測(cè)其在波長(zhǎng)530 nm條件下的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。培養(yǎng)PN1和PN6菌液15 d，以未接菌的NB液體培養(yǎng)基為對(duì)照。菌懸浮液與對(duì)照離心10 min（10 000 r·min-1）后取上清液進(jìn)行IAA含量的測(cè)定，IAA含量測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法[17]。

1.2.6 內(nèi)生拮抗細(xì)菌PN1和PN6鑒定 菌株P(guān)N1和PN6形態(tài)與生理生化分析參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]和利用Biolog鑒定，Biolog系統(tǒng)鑒定方法具體步驟參照該系統(tǒng)的鑒定說明書。DNA提取采用CTAB法[19]，采用1 495 r和27 f引物，PCR產(chǎn)物送金斯瑞生物科技公司測(cè)序，測(cè)序得到的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)中并進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載相關(guān)基因序列，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[20]。

1.2.7 內(nèi)生細(xì)菌PN1和PN6對(duì)毛竹促生作用 將菌株P(guān)N1和PN6活化后，用接種環(huán)挑取少量菌體接種于NB培養(yǎng)基中28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液（4℃，5 000 ×g）離心5 min，無菌生理鹽水潤(rùn)洗菌體3次并調(diào)節(jié)菌懸液（108cfu·mL-1）制成液體菌劑。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，培養(yǎng)基質(zhì)按照土壤∶砂子∶蛭石=2∶1∶1的配比混合，設(shè)置對(duì)照（等量無菌生理鹽水）、單獨(dú)施用解磷菌PN1和PN6 3個(gè)處理。于當(dāng)年4月份采用灌根的方式分別施用于毛竹根際土壤里，菌劑施用量為10 mL·株-1，各處理20 株。在栽培180 d 時(shí)測(cè)定毛竹苗高、地徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS和Origin分析軟件做統(tǒng)計(jì)和制圖，運(yùn)用單因素方差分析抑菌活性、解磷量和分泌IAA量和促生試驗(yàn)數(shù)據(jù)（P＜0.05）。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹根系內(nèi)生細(xì)菌的分離及純化

細(xì)菌分離數(shù)量結(jié)果顯示，毛竹根系存在豐富的細(xì)菌資源，3個(gè)采樣點(diǎn)共分離純化得到118株細(xì)菌，各采樣點(diǎn)均分離到約40株內(nèi)生細(xì)菌（表1）。

表 1 采集地毛竹根系細(xì)菌分離數(shù)量 Table 1 The quantity of bacteria from Ph. edulis roots

2.2 毛竹枯梢病病原菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，從毛竹根系中分離純化的118株細(xì)菌中，對(duì)竹喙球菌有拮抗作用的菌株有16株，其中菌株P(guān)N1和PN6對(duì)病原菌竹喙球菌有較強(qiáng)抑菌活性（圖1）。平板抑菌帶寬度分別可達(dá)2.81 cm和2.13 cm（表2）。菌株P(guān)N1和PN6發(fā)酵液對(duì)竹喙球菌也具有較好的抑菌活性，抑菌效果分別可達(dá)58.82%和49.28%（表2）。

2.3 菌株P(guān)N1和PN6生長(zhǎng)曲線比較

由圖2可知，菌株P(guān)N1和PN6的菌液OD600值在0～30 h增長(zhǎng)較快，菌株P(guān)N1在接種后約36 h內(nèi)達(dá)到最大值2.30，而菌株P(guān)N6在接種42 h后達(dá)最大值2.18。之后2株細(xì)菌的OD600值的變化差異不明顯，標(biāo)志菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期（圖2）。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中菌株P(guān)N1和PN6的菌體密度在培養(yǎng)36 h和42 h后分別增加了約125倍和116倍，且菌株P(guān)N1的生長(zhǎng)能力高于菌株P(guān)N6。

圖 1 2株內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)病原菌平板對(duì)抗 A: PN1; B: PN6Fig. 1 The inhibition zone of strain PN1 and PN6 to pathogenic fungi. A: PN1; B: PN6

表 2 菌株P(guān)N1和PN6對(duì)竹喙球菌的抑菌活性Table 2 The antagonistic function of antagonistic bacteria PN1 and PN6 to pathogenic fungi

圖 2 菌株P(guān)N1和PN6在NB培養(yǎng)基中30 ℃下的生長(zhǎng)情況Fig. 2 Growth of strains PN1 and PN6 in NB medium at 30 ℃

2.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌PN1和PN6解磷能力的測(cè)定

菌株P(guān)N1和PN6在NBRIP固體培養(yǎng)基均有解磷圈，具有較好的解磷能力（圖3）。將菌株P(guān)N1和PN6分別接種于NBRIP-BPB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3 d和6 d后，測(cè)定菌株P(guān)N1和PN6對(duì)磷酸三鈣的溶解能力。結(jié)果顯示，這2株細(xì)菌在第3 d和6 d均具有較強(qiáng)的解磷能力，菌株P(guān)N1解磷量分別為179 mg·L-1和236.33 mg·L-1，菌株P(guān)N6解磷量分別為203.67 mg·L-1和278.21 mg·L-1（圖4）。

圖 3 菌株P(guān)N1和PN6在NBRIP培養(yǎng)基產(chǎn)生的解磷圈（A：PN1；B：PN6）Fig. 3 The halo of strain PN1 and PN6 in NBRIP medium（A：PN1；B：PN6）

圖 4 菌株P(guān)N1和PN6在30 ℃振蕩培養(yǎng)3 d和6 d時(shí)培養(yǎng)液中可溶性磷含量Fig. 4 Soluble phosphorus concentration in culture liquid of strains PN1 and PN6 in 30 ℃ between 3 days and 6 days

2.5 內(nèi)生拮抗細(xì)菌PN1和PN6產(chǎn)IAA能力

采用Salkowski比色法對(duì)菌株P(guān)N1和PN6定量測(cè)定，結(jié)果顯示菌株P(guān)N1和PN6有著較好的分泌IAA能力，其IAA分泌量分別為15.17 mg·L-1和12.36 mg·L-1（圖5）。

圖 5 菌株P(guān)N1和PN6產(chǎn)IAA能力Fig. 5 IAA-producing activity of strains PN1 and PN6

2.6 菌株P(guān)N1和PN6的鑒定

2.6.1 菌株P(guān)N1和PN6的形態(tài)、生理生化特性 菌株P(guān)N1和PN6在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落均呈圓形，顏色呈淡乳白色，不透明（圖6）。顯微觀察結(jié)果顯示，2株細(xì)菌均為桿菌；生理生化特征分析顯示，2株細(xì)菌均屬于好氧性革蘭氏陰性桿菌（表3）。

圖 6 菌株P(guān)N1和PN6的菌落形態(tài)（A：PN1；B：PN6）Fig. 6 The colony morphology of strains PN1 and PN6 (A: PN1; B: PN6)

表 3 菌株P(guān)N1和PN6生理生化特征Table 3 Biochemical and physiological characteristics of strains PN1 and PN6

2.6.2 菌株P(guān)N1和PN6的Biolog鑒定 將分離純化的PN1和PN6于Biolog鑒定板30℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，置Biolog自動(dòng)微生物鑒定儀上讀數(shù)到相似值（SIM）均大于0.5，符合鑒定系統(tǒng)的要求。菌株P(guān)N1和PN6分別鑒定為Burkholderia lata和Enterobacter ludwigii。

2.6.3 菌株P(guān)N1和PN6的16S rDNA鑒定 菌株P(guān)N1和PN6的16S rDNA基因序列已提交至GenBank中（登錄號(hào)為MF285775和MG452788）。由圖7的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，菌株P(guān)N1與Burkholderia lata聚類同一個(gè)分支，相似度達(dá)98%，菌株P(guān)N6與Enterobacter ludwigii聚類同一個(gè)分支，相似度達(dá)100%，說明具有較接近的親緣關(guān)系，參照菌落形態(tài)特征和生理生化等指標(biāo)，菌株P(guān)N1鑒定為B. lata，PN6鑒定為E. ludwigii。

2.7 菌株P(guān)N1和PN6對(duì)毛竹實(shí)生苗的促生長(zhǎng)作用

施用菌劑180 d后菌株P(guān)N1和PN6均能促進(jìn)毛竹實(shí)生苗的生長(zhǎng)（圖8）。施菌處理后毛竹的苗高和地徑均顯著高于對(duì)照，菌株P(guān)N1和PN6處理的地徑增長(zhǎng)率分別為39.51%和42.59%，苗高增長(zhǎng)率分別為54.42%和62.51%（表4）。

3 討論

植物體內(nèi)分布著多種內(nèi)生真菌、細(xì)菌等有益微生物，這些微生物與植物在長(zhǎng)期發(fā)育進(jìn)化過程中形成了穩(wěn)定的定殖環(huán)境，在維持植物健康方面發(fā)揮著重要作用[21]。目前利用內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治方面的研究從廣度到深度均取得了快速發(fā)展[22-23]。如Orawan等人從柑桔中分離出內(nèi)生細(xì)菌芽孢桿菌對(duì)柑桔潰瘍病有較好的拮抗作用[24]；李亮亮從松樹體內(nèi)分離出3株細(xì)菌，經(jīng)發(fā)酵液浸漬試驗(yàn)顯示3株細(xì)菌對(duì)松材線蟲有較高殺線活性[25]；Wicaksono從獼猴桃分離出5株內(nèi)生細(xì)菌，拮抗試驗(yàn)顯示5株細(xì)菌對(duì)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病病原菌丁香假單胞菌Pseudomonas syringae具有較強(qiáng)的拮抗作用，并發(fā)現(xiàn)其中3種內(nèi)生細(xì)菌能通過接種試驗(yàn)成功定殖在獼猴桃體內(nèi)，顯著降低潰瘍病的發(fā)生程度[26]。一系列研究結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌在防治植物病害方面具有一定功效，且有較強(qiáng)的適生性，易在植物體內(nèi)定殖、形成種群優(yōu)勢(shì)，不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成危害[11,21]。因此，本試驗(yàn)篩選出菌株P(guān)N1和PN6可為今后生物防治毛竹枯梢病時(shí)優(yōu)先考慮應(yīng)用的菌株。迄今關(guān)于拮抗細(xì)菌抗病性的相關(guān)機(jī)制可能是其產(chǎn)生某些抗病原菌的低分子量化學(xué)物質(zhì)，如木質(zhì)素、胼胝質(zhì)和多聚物等，也可能是通過誘導(dǎo)一些水解酶、氧化酶類以及相關(guān)蛋白的產(chǎn)生進(jìn)行[27]。本試驗(yàn)篩選的菌株P(guān)N1和PN6分別為Burkholderia lata和Enterobacter ludwigii，以往研究顯示，Burkholderiasp.對(duì)病原菌的抑制機(jī)制主要與其產(chǎn)生的木假絲菌素、洋蔥菌素吩嗪、硝吡咯菌素和賽派素等相關(guān)代謝產(chǎn)物密切相關(guān)[17]，Enterobactersp.對(duì)病原菌的抑制機(jī)制主要是通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)分解酶來抑制病原菌活性[28]。本研究中這2株細(xì)菌產(chǎn)生何種代謝產(chǎn)物來抑制竹喙球菌尚不清楚，具體拮抗機(jī)制還有待研究，以便在今后防治毛竹枯梢病時(shí)發(fā)揮其最大潛力。

圖 7 基于16S rDNA序列菌株P(guān)N1和PN6的系統(tǒng)進(jìn)化樹（A：PN1；B：PN6）Fig. 7 Phylogenetic tree of strain PN1 and PN6 based on 16S rDNA sequence (A: PN1; B: PN6)

圖 8 施用菌株P(guān)N1和PN6對(duì)毛竹促生效果的盆栽試驗(yàn)（180 d）Fig. 8 Inoculated with phosphate-solubilizing fungi PN1 and PN6 for Ph. edulis growth promotion in pot experiment (180 d)

近年來，內(nèi)生細(xì)菌除了具有防治植物病害的能力外，其它生物學(xué)功能也屢見報(bào)道[10,29]。如姚玉玲從高寒草地矮生嵩草中分離1株內(nèi)生細(xì)菌263AG5，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)馬鈴薯炭疽病病原菌有較好的抑制作用，對(duì)磷酸三鈣具有較好的溶解作用，此外還具有固氮和產(chǎn)IAA功能[30]；Daniel篩選出2株內(nèi)生細(xì)菌E25和CR71，能釋放揮發(fā)性有機(jī)化合物，對(duì)植物灰霉病有顯著的拮抗作用，溫室試驗(yàn)顯示這2株細(xì)菌能顯著提高番茄葉綠素含量和生物量[31]；Zhao從河南大豆根瘤中分離276株內(nèi)生細(xì)菌，通過對(duì)大豆疫霉菌的拮抗試驗(yàn)篩選出6株抑菌活性較強(qiáng)的細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)這些菌株具有產(chǎn)鐵載體、IAA及固氮功能[32]。與已報(bào)的功能菌株相比，本研究中篩選出的菌株P(guān)N1和PN6具有較好的分泌IAA能力和抑菌功能，且對(duì)磷酸三鈣具有較好的溶解作用，其產(chǎn)IAA和解磷能力可比其他菌株強(qiáng)至2～3倍[26,30,32]，盆栽接種試驗(yàn)也顯示這2株細(xì)菌對(duì)毛竹實(shí)生苗具有顯著的促生長(zhǎng)作用，該結(jié)果顯示了這2株細(xì)菌具有多功能特性，具有開發(fā)成為抗病促生相關(guān)生物菌劑的潛力。以往部分研究證實(shí)內(nèi)生細(xì)菌可通過抑制病原菌的侵染、提高寄主對(duì)逆境的抗性和通過產(chǎn)生植物激素、提高植物對(duì)有效養(yǎng)分的吸收等方式來促進(jìn)植物生長(zhǎng)[33]。我國(guó)毛竹主要分布于江西、浙江等亞熱帶丘陵紅壤地區(qū)[34]，這些地區(qū)土壤由于水土流失嚴(yán)重導(dǎo)致氮、磷、鉀等養(yǎng)分供應(yīng)不足，極大地限制了竹林的持續(xù)經(jīng)營(yíng)和利用[35]。如最近研究表明磷已成為毛竹產(chǎn)量提升的主要制約因子[36]。因此，篩選出具有多功能生物學(xué)特性的細(xì)菌對(duì)于防治毛竹枯梢病及提高竹林土壤養(yǎng)分含量是一條有效的生物途徑[34]。而本試驗(yàn)所篩選的菌株P(guān)N1和PN6既能降低在定殖于毛竹體內(nèi)時(shí)的生防效應(yīng)，又能較小受到來自土著微生物的干擾，為毛竹生長(zhǎng)過程提供有效養(yǎng)分，進(jìn)而提高竹林生產(chǎn)力。同時(shí)，本研究的結(jié)果也擴(kuò)充了促生細(xì)菌種質(zhì)資源，為改善毛竹養(yǎng)分有效性提供了新的生物途徑，也間接證實(shí)內(nèi)生細(xì)菌也是優(yōu)良促生菌株的重要資源庫(kù)[37]。

表 4 接種菌株P(guān)N1和PN6對(duì)毛竹實(shí)生苗生長(zhǎng)的影響（180 d）Table 4 The effect of adding strains PN1 and PN6 on the growth of Ph. edulis seedling (180 d)

4 結(jié)論

本研究從毛竹根系中分離到16株對(duì)毛竹枯梢病病原菌竹喙球菌（C. phyllostachydis）具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，其中菌株P(guān)N1和PN6的抑菌活性最顯著，這2株細(xì)菌也具有較好的解磷能力和分泌IAA能力。菌株P(guān)N1和PN6分別被鑒定為Burkholderia lata和Enterobacter ludwigii。盆栽結(jié)果顯示2株細(xì)菌均能顯著促進(jìn)毛竹實(shí)生苗生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明這2株細(xì)菌具有多功能特性，具有開發(fā)成為抗病促生相關(guān)生物菌劑的潛力。