可構(gòu)建不同三維微環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)芯片設(shè)計(jì)與制作*

陳淑豪，劉 沖，丁來錢，何玫娟，李經(jīng)民※

（1.大連理工大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，遼寧大連 116024；2.大連理工大學(xué)遼寧省微納技術(shù)及系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116024）

0 引言

細(xì)胞是生命體的基本單元，細(xì)胞層面的各類研究在探尋生命規(guī)律、研究疾病病理、藥物開發(fā)及篩選等方面有不可或缺的價(jià)值[1]。細(xì)胞培養(yǎng)作為生命科學(xué)領(lǐng)域中最重要的研究技術(shù)，關(guān)鍵在于如何在體外構(gòu)建與在體細(xì)胞生存環(huán)境相似的微環(huán)境[2-3]。已有大量研究表明細(xì)胞生存的三維微環(huán)境中各種細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）相互粘附作用中的多種信號(hào)積極參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、繁殖及凋亡等生命活動(dòng)[4-5]。

近年來，微流控技術(shù)快速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞研究。微流控芯片憑借其體積小、高通量、試劑消耗少、樣本量需求小等優(yōu)越性能，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行二維或三維培養(yǎng)[6]。相比二維環(huán)境，三維培養(yǎng)能更真實(shí)還原細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和行為表現(xiàn)[7]。三維細(xì)胞培養(yǎng)微流控芯片設(shè)計(jì)已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Benjamin等[8]設(shè)計(jì)了一種三層微流控裝置用于模擬腫瘤細(xì)胞穿過血管的過程。裝置中層的微孔parylene膜能模擬血管壁的支撐結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行水凝膠處理為細(xì)胞提供三維生長(zhǎng)環(huán)境。Carlos 等[9]設(shè)計(jì)的微流控裝置能對(duì)3D-ECM 水凝膠進(jìn)行圖案化，通過建模分析了微器件中集成三維凝膠的微結(jié)構(gòu)尺寸，并觀察了三維空間中乳腺癌細(xì)胞受巨噬細(xì)胞影響的表型。Ioannis 等[10]開發(fā)了一種基于微流控技術(shù)的構(gòu)建三維血管界面的方法，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)內(nèi)皮屏障功能。芯片中引入生物水凝膠形成三維的觀測(cè)界面。劉軍山等[11]制作并驗(yàn)證了一種用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的集成微柱陣列的微流控芯片，對(duì)微柱間距進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。Supriya 等[12]開發(fā)的三維細(xì)胞培養(yǎng)微流控平臺(tái)可以研究腫瘤與內(nèi)皮細(xì)胞之間的雙向串?dāng)_。綜合分析各種三維細(xì)胞培養(yǎng)微流控器件，微柱結(jié)構(gòu)包裹ECM模擬材料（如鼠尾膠原），能在相鄰微空間實(shí)現(xiàn)生物化學(xué)信息交流，適用于模擬在體微環(huán)境下的細(xì)胞生長(zhǎng)。但芯片的微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)對(duì)ECM 水凝膠包裹效果的影響，以及芯片設(shè)計(jì)在構(gòu)建仿生三維微環(huán)境和構(gòu)建用于對(duì)比的不同微環(huán)境的研究仍有待完善。

本文設(shè)計(jì)了一種可建立不同三維微環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)微流控芯片。在建模仿真優(yōu)化芯片微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的同時(shí)，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)池兩側(cè)形成的不同小分子濃度分布微環(huán)境進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。所設(shè)計(jì)的芯片能為細(xì)胞與微環(huán)境相互作用機(jī)制的研究提供一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)。

1 芯片設(shè)計(jì)及仿真分析

1.1 芯片整體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

本文設(shè)計(jì)的三維細(xì)胞培養(yǎng)微流控芯片如圖1 所示。芯片選用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）制作成型，PDMS具有良好的生物相容性和透氣性，適合作為細(xì)胞培養(yǎng)的基底材料，且其透光性好便于觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)[2]。芯片由下層結(jié)構(gòu)片和上層蓋片組成，芯片的微結(jié)構(gòu)主要包括細(xì)胞培養(yǎng)池、3D-ECM 水凝膠微通道、微柱和培養(yǎng)液微通道。在細(xì)胞培養(yǎng)池兩側(cè)設(shè)計(jì)具有間隙的微柱結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞培養(yǎng)池與兩側(cè)并置凝膠通道形成連續(xù)界面，允許細(xì)胞和旁通道微空間相互作用。芯片中心微通道上串聯(lián)3 個(gè)寬度600 μm 的圓形細(xì)胞培養(yǎng)池，樣本能以高密度植入培養(yǎng)池從而增大樣本數(shù)。兩側(cè)結(jié)構(gòu)呈對(duì)稱設(shè)計(jì)，向外依次為凝膠微通道和最外側(cè)培養(yǎng)液微通道，寬度均為400 μm。水凝膠可以獨(dú)立地填充至2 個(gè)凝膠微通道，封裝在局部微柱中從而建立三維環(huán)境。通過調(diào)整最外側(cè)溶液成分可調(diào)節(jié)小分子擴(kuò)散下微環(huán)境狀態(tài)。此外，芯片微柱結(jié)構(gòu)的形狀設(shè)計(jì)影響水凝膠封裝的性能，研究分析了不同微柱對(duì)封裝3D-ECM 水凝膠的效果從而優(yōu)化芯片設(shè)計(jì)。確定微柱為直徑150 μm 的圓形結(jié)構(gòu)，間隙為50 μm；凝膠微通道寬度為400 μm，高150 μm。

圖1 微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 微柱結(jié)構(gòu)仿真優(yōu)化

為實(shí)現(xiàn)在芯片上建立模擬在體3D-ECM 的空間環(huán)境，在芯片中引入生物水凝膠材料（如鼠尾膠原）。芯片中帶間隙的微柱結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)影響區(qū)域圖案化水凝膠的效果。水凝膠溶液在微柱間隙的封裝由前進(jìn)界面的壓力差決定，根據(jù)Younglaplace方程（方程表明，氣液壓力差是表面張力和界面曲率的函數(shù)）可計(jì)算溶液界面壓力差[9]，如下所示：

式中：γ 為溶液的表面張力；θs為液體與側(cè)壁的前進(jìn)接觸角；θv為液體與上下壁的前進(jìn)接觸角；w和h分別為微通道的寬度和高度。

圖2 模擬膠原溶液注入的幾何模型

水凝膠溶液注入過程中與微柱側(cè)壁的接觸角隨著微柱形狀變化而改變，在此對(duì)梯形、六邊形、八邊形和圓形（外接圓直徑均為150 μm）微柱封裝性能進(jìn)行仿真分析。由于芯片設(shè)計(jì)在高度方向結(jié)構(gòu)一致，可對(duì)水凝膠注入微通道建立二維模型進(jìn)行模擬仿真，圖2所示為基本的梯形模型，箭頭方向表示水凝膠溶液的入口和出口，梯形側(cè)邊AB范圍內(nèi)分析水凝膠的封裝效果。根據(jù)水凝膠注入的微通道尺寸變化的影響[9]，選定微通道寬度為400 μm。根據(jù)對(duì)微柱間隙的相關(guān)研究[11]，微柱間隙設(shè)定50 μm。用Comsol 5.3兩相流-水平集物理場(chǎng)，模擬膠原溶液注入具有不同微結(jié)構(gòu)芯片的過程。

仿真參數(shù)設(shè)置如下：（1）膠原溶液濃度為1 mg/mL，用流變儀測(cè)得的黏度為0.036 Pa·s，用液滴形狀分析儀測(cè)得的表面張力系數(shù)為0.060 N/m；（2）選定水凝膠溶液入口，設(shè)定入口壓力1 000 Pa；選定出口，設(shè)定出口壓力為0；（3）濕潤(rùn)壁接觸角設(shè)置為41°，芯片的制作工藝中采用氧等離子表面處理鍵合兩層PDMS，也對(duì)微通道親疏水性進(jìn)行改性，用液滴形狀分析儀測(cè)得膠原溶液與改性后的PDMS 接觸角為41°；（4）細(xì)化網(wǎng)格，使用瞬態(tài)求解器計(jì)算水凝膠注入不同微結(jié)構(gòu)的封裝效果。結(jié)果如圖3 所示，水凝膠溶液在110 ms 可注滿模型，相比梯形微柱間隙溶液已經(jīng)有溢出，圓形微柱溶液界面未越過間隙。此外圓形微柱能長(zhǎng)時(shí)間保持溶液界面不溢出間隙，對(duì)水凝膠溶液的封裝效果最佳。

圖3 不同形狀微柱封裝效果仿真結(jié)果對(duì)比

1.3 芯片兩側(cè)構(gòu)建不同微環(huán)境的仿真分析

細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境中，控制周圍可溶性小分子濃度梯度，對(duì)于研究生物化學(xué)信號(hào)誘導(dǎo)生物反應(yīng)的定量關(guān)系至關(guān)重要。本文對(duì)封裝水凝膠后芯片的三維空間中小分子擴(kuò)散進(jìn)行三維仿真。用Comsol 5.3 仿真軟件中的多孔介質(zhì)流動(dòng)物理場(chǎng)和稀物質(zhì)傳遞物理場(chǎng)耦合，對(duì)單培養(yǎng)池的模型計(jì)算分析，獲得了小分子濃度隨時(shí)間變化的分布。仿真參數(shù)設(shè)置如下：（1）外側(cè)旁通道流動(dòng)類型為層流，封裝水凝膠的微通道流動(dòng)類型為多孔介質(zhì)流，壁面無滑移；（2）多孔基體滲透率為2×10-9m2，孔隙率為0.98（排液法測(cè)得）；（3）外側(cè)培養(yǎng)液兩通道入口速度為2 μL/min，出口處抑制回流且出口壓力為0；（4）葡萄糖作為培養(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在此用葡萄糖來代表微環(huán)境中小分子物質(zhì)，兩個(gè)培養(yǎng)液微通道入口濃度分別設(shè)為50 mmol/L（高糖）和10 mmol/L（低糖），葡萄糖擴(kuò)散系數(shù)為0.96×10-9m2/s（37 ℃）。

分析結(jié)果如圖4 所示。在微流控芯片中，并置微通道的連續(xù)界面上（如截線）可以生成介于外側(cè)培養(yǎng)液通道葡萄糖濃度之間的濃度梯度，如圖4（a）所示。截線處的連續(xù)界面上，葡萄糖濃度梯度隨時(shí)間發(fā)生變化，如圖4（b）所示，芯片內(nèi)2 h可以形成較穩(wěn)定的濃度分布，保證了芯片內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定性。在培養(yǎng)池兩側(cè)的水凝膠微空間中構(gòu)建了兩種不同的小分子濃度刺激（圖4（b）虛線標(biāo)記處），形成了兩種不同的微環(huán)境。在培養(yǎng)池中三維培養(yǎng)細(xì)胞，可在培養(yǎng)池兩側(cè)的連續(xù)界面中對(duì)比研究不同微環(huán)境下的細(xì)胞生長(zhǎng)特性。

圖4 芯片微環(huán)境的生化因子濃度變化分析

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 微流控芯片制作

該微流控芯片采用澆注成型的方法制作。制作過程：（1）利用微加工技術(shù)制作模具，模具的制作工藝流程如圖5所示；（2）澆注PDMS 溶液，80 ℃下固化2 h 后拔模；（3）用等離子體清洗機(jī)對(duì)PDMS下層結(jié)構(gòu)片和上層蓋片進(jìn)行氧等離子體處理，對(duì)準(zhǔn)鍵合完成芯片制作，芯片實(shí)物如圖6所示。

圖5 芯片結(jié)構(gòu)片的制作工藝流程

圖6 芯片實(shí)物圖

圖7 芯片內(nèi)水凝膠的封裝

2.2 芯片三維微環(huán)境構(gòu)建驗(yàn)證

2.2.1 水凝膠封裝實(shí)驗(yàn)

對(duì)優(yōu)化設(shè)計(jì)的微流控芯片注入Ⅰ型膠原溶液，驗(yàn)證芯片微結(jié)構(gòu)的封裝性能。稀釋5 mg/mL膠原溶液為1 mg/mL，稀釋溶液為0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS），并加入0.1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至中性。使用移液槍將30 μL 膠原溶液注入微通道入口。在工具顯微鏡下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了圓形微柱的水凝膠封裝效果最佳，將膠原溶液灌注至芯片的水凝膠微通道，5 s可注滿單個(gè)微通道，且在微柱間隙產(chǎn)生穩(wěn)定的氣液界面。水凝膠封裝在微柱區(qū)域且放置長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)溢出，如圖7所示，紅色染料染色水凝膠便于觀察。

2.2.2 不同三維微環(huán)境建立驗(yàn)證

圖8 小分子擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

為了研究芯片中細(xì)胞培養(yǎng)池兩側(cè)形成的微環(huán)境分布，對(duì)完成封裝凝膠的芯片進(jìn)行小分子擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中用熒光素鈉（擴(kuò)散系數(shù)0.36×10-9m2/s）模擬生化因子，與葡萄糖的擴(kuò)散速度相近。利用倒置熒光顯微鏡搭建實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，如圖8所示?？刂莆⒆⑸浔眉訅和瑫r(shí)驅(qū)動(dòng)芯片外側(cè)2個(gè)旁通道的熒光素溶液流動(dòng)，形成穩(wěn)定的層流狀態(tài)，流速為2 μL/min。2個(gè)旁通道中以濃度比5∶1的熒光素鈉溶液進(jìn)行第1組實(shí)驗(yàn)，其中高濃度一側(cè)熒光素濃度為50 μmol/L。設(shè)置顯微鏡每隔5 min拍照一次，實(shí)驗(yàn)記錄了兩側(cè)三維凝膠通道的熒光擴(kuò)散狀態(tài)，從而進(jìn)行兩側(cè)水凝膠空間微環(huán)境對(duì)比。此外，調(diào)整熒光素鈉濃度比2∶1進(jìn)行第2組實(shí)驗(yàn)，高濃度一側(cè)熒光素濃度為40 μmol/L。

熒光素鈉在芯片三維空間擴(kuò)散如圖9所示。利用Matlab軟件對(duì)熒光圖像進(jìn)行處理，表征熒光素鈉在膠原水凝膠微環(huán)境分析區(qū)域（圖9（a）標(biāo)記處）的擴(kuò)散情況。芯片中熒光素分子可在2.5 h擴(kuò)散穩(wěn)定，形成了穩(wěn)定的濃度梯度。在同組實(shí)驗(yàn)中，對(duì)稱2 個(gè)水凝膠旁通道可形成兩種不同濃度的穩(wěn)定微環(huán)境，如圖9（b）所示。第1 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在兩側(cè)的三維基質(zhì)空間形成了差距較大的高低兩種穩(wěn)定的小分子濃度分布；第2組實(shí)驗(yàn)在兩側(cè)三維基質(zhì)環(huán)境中減緩了濃度差距，也形成了不同的穩(wěn)定小分子濃度環(huán)境。這實(shí)現(xiàn)了芯片中培養(yǎng)池兩側(cè)不同小分子濃度微環(huán)境的控制。

圖9 芯片微環(huán)境內(nèi)熒光素濃度表征

3 結(jié)束語

本文設(shè)計(jì)了一種能構(gòu)建不同三維微環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)微流控芯片。通過建模仿真優(yōu)化了芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，確定了圓形微柱用于封裝水凝膠，并模擬兩個(gè)三維基質(zhì)空間中的小分子擴(kuò)散分布。利用微加工工藝制作芯片，并驗(yàn)證了芯片封裝水凝膠構(gòu)建三維微環(huán)境的效果。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了芯片內(nèi)部建立擴(kuò)散小分子高低兩種濃度的微環(huán)境，通過調(diào)節(jié)不同的外側(cè)培養(yǎng)液組分可控制多種穩(wěn)定微環(huán)境的形成。芯片可用于體外模擬細(xì)胞生長(zhǎng)與微環(huán)境相互作用的各種分析研究。