體外模擬胃腸道消化和結(jié)腸發(fā)酵對(duì)長(zhǎng)黑青稞多酚生物有效性和抗氧化活性的影響

陳 壁，黃勇樺，張建平，朱昱琳，李 淳，初雅潔，楊士花，李 晴，李梓毓，黃艾祥，李永強(qiáng),*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院，云南 普洱 665099；3.云南昆明國(guó)家糧食儲(chǔ)備中轉(zhuǎn)庫(kù)，云南 昆明 650201；4.永平縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)院，云南 永平 672660；5.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 大理 671003；6.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語學(xué)院，云南 昆明 650201）

青稞（Hordeum vulgareL. var. nudum Hook.f.）屬禾本科大麥屬，主要分布在西藏、青海、四川以及云南等省區(qū)，是青藏高原高寒地區(qū)唯一能夠成熟的作物，不但具有“三高兩低”（高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪和低糖）的營(yíng)養(yǎng)特性，而且在抗逆環(huán)境中積累了豐富的多酚化合物[1]。多酚化合物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗衰老等作用，能夠預(yù)防心血管疾病、II型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，越來越受到人們的關(guān)注[2]。

多酚的生物有效性是指能夠從食物基質(zhì)中釋放出來并可被吸收的多酚化合物的量[3]。多酚化合物只有具有較好的生物有效性才可能被人體吸收利用，發(fā)揮其生物學(xué)功效，從而促進(jìn)人體健康。但是多酚化合物的生物有效性較低，只有5%～10%的多酚能夠在小腸中被吸收，剩余的多酚會(huì)進(jìn)入結(jié)腸，在腸道微生物作用下，一方面能夠從食品基質(zhì)中釋放出來，形成游離的多酚化合物；另一方面，可以被分解生成有利于人體吸收的小分子化合物[4]；同時(shí)，多酚能夠調(diào)節(jié)腸道微生物群，對(duì)人體健康產(chǎn)生積極的作用[5]。

生物有效性研究方法主要包括體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一般采用動(dòng)物模型，準(zhǔn)確度較高，但是存在檢測(cè)指標(biāo)多且復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴、涉及倫理問題等不足[6]。體外實(shí)驗(yàn)一般采用體外胃腸道消化模型和Caco-2細(xì)胞模型。體外胃腸道消化模型方法簡(jiǎn)單、成本低、時(shí)間短、效果好，沒有個(gè)體差異，不需顧慮倫理問題，但與體內(nèi)環(huán)境下真實(shí)的生物有效性存在一定差異[7]。Caco-2細(xì)胞模型易于培養(yǎng)、重復(fù)性較好，但由于缺少部分代謝酶，與小腸上皮細(xì)胞存在一定差異，不能準(zhǔn)確反映體內(nèi)環(huán)境下的生物有效性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，利用體外胃腸道消化模型對(duì)不同的谷物樣品[9]和馬鈴薯及甘薯[10]進(jìn)行模擬消化，其多酚化合物的生物有效性和抗氧化活性均得到提高。由于多酚化合物在上消化道中生物有效性較低，大部分會(huì)進(jìn)入結(jié)腸，在結(jié)腸微生物的作用下進(jìn)一步被分解代謝。許多學(xué)者利用結(jié)腸發(fā)酵模型研究了多酚化合物的生物有效性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)堅(jiān)果[11]、角豆粉[12]經(jīng)結(jié)腸發(fā)酵后，多酚化合物的生物有效性和抗氧化活性得到較大改善。利用體外胃腸道消化和結(jié)腸發(fā)酵模型可以完整地模擬食物中多酚化合物在體內(nèi)的吸收和代謝，能夠更加客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)其生物有效性和抗氧化活性。通過結(jié)合體外胃腸道消化和結(jié)腸發(fā)酵模型對(duì)咖啡殘?jiān)黐13]、大棗籽[14]進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中多酚化合物的生物有效性和抗氧化活性進(jìn)一步得到提高。目前關(guān)于利用體外模擬胃腸道消化結(jié)合結(jié)腸發(fā)酵模型探究青稞多酚化合物的生物有效性和抗氧化活性的文獻(xiàn)鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以青稞為原料，通過體外模擬胃腸道消化和結(jié)腸發(fā)酵，研究青稞多酚的生物有效性和抗氧化活性，為探究青稞對(duì)人類健康的促進(jìn)作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長(zhǎng)黑青稞購(gòu)于云南香格里拉市迪慶州農(nóng)科所；沒有胃腸道疾病且6 個(gè)月內(nèi)沒有使用過抗生素的豬的糞便，采自云南省普洱市景谷朱源家庭養(yǎng)殖農(nóng)場(chǎng)。

沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香草醛、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、反式肉桂酸、兒茶素、表兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素、楊梅素、槲皮素、山柰酚、芹菜素購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；糖化酶、堿性蛋白酶購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridy1)-S-triazine，TPTZ）、2,2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、FeCl3、FeSO4、NaOH，HCl、乙醇購(gòu)于上海晶純生化科技股份有限公司；豬α-淀粉酶、豬胃蛋白酶、豬胰液素、豬黏液素、膽汁鹽、1,1-二苯基-2-苦基肼基（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、Folin-Ciocalteu試劑、Trolox購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；A360型紫外-可見分光光度計(jì) 翱藝儀器（上海）有限公司；TS-211B型恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將長(zhǎng)黑青稞除雜，磨粉過50 目篩，于-20 ℃冰箱密封保存。

1.3.2 青稞總可溶多酚化合物的提取

青稞總可溶多酚化合物的提取參照Chandrasekara[15]、Li Qing[16]等的方法，主要步驟如下：準(zhǔn)確稱取2 g長(zhǎng)黑青稞面粉，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)70%丙酮溶液，室溫下避光超聲提取15 min后，4 000 r/min離心10 min，重復(fù)3 次，合并上清液，即得總可溶多酚化合物，并進(jìn)行酚類化合物的含量、抗氧化活性測(cè)定和組成分析。

1.3.3 體外模擬胃腸道消化和結(jié)腸發(fā)酵

1.3.3.1 體外模擬胃消化

體外模擬胃消化實(shí)驗(yàn)參照鄒青飛等[17]的方法，主要步驟如下：準(zhǔn)確稱取1 g青稞面粉，再依次加入10 mL 0.85% NaCl溶液、15 mL蒸餾水和1 mL豬α-淀粉酶，混合均勻后，37 ℃水浴消化5 min，然后調(diào)節(jié)pH值至2.0，再加入1 mL豬胃蛋白酶，充氮?dú)夂笥?7 ℃搖床避光消化2 h，得到胃消化懸濁液，用于酚類化合物的含量、抗氧化活性測(cè)定和組成分析，并進(jìn)行下一步胃腸消化實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 體外模擬胃腸消化

體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)參照鄒青飛等[17]的方法，主要步驟如下：胃消化懸濁液用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5，再依次分別加入膽汁鹽、豬胰液素和豬黏液素，樣品充氮?dú)夂笥?7 ℃搖床避光消化3 h，12 000 r/min離心30 min，重復(fù)3 次，合并上清液，用于酚類化合物的含量、組成和抗氧化活性測(cè)定，殘?jiān)鼉龈珊?，充氮?dú)獠⒂?80 ℃保存，用于體外結(jié)腸發(fā)酵。

1.3.3.3 體外結(jié)腸發(fā)酵

體外結(jié)腸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)參照鄒青飛等[17]的方法。設(shè)置空白組和樣品組，空白組加入糞便接種物和結(jié)腸發(fā)酵培養(yǎng)基，樣品組加入胃腸消化殘?jiān)?、接種物和結(jié)腸發(fā)酵培養(yǎng)基。主要步驟如下：胃腸消化殘?jiān)尤氲揭褱缇慕Y(jié)腸發(fā)酵培養(yǎng)基中，在4 ℃冰箱中水合16 h，然后加入15 mL糞便接種物，充氮?dú)庥趽u床中避光條件下分別培養(yǎng)0、5、10、24、30 h和48 h，所得發(fā)酵液于11 000 r/min離心10 min，重復(fù)3 次，合并上清液，用于酚類化合物的含量、抗氧化活性測(cè)定和組成分析。

1.3.4 總酚含量測(cè)定

總酚含量參考Chandrasekara等[9]的方法，利用Folin-Ciocalteau法進(jìn)行測(cè)定，以阿魏酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果用每克長(zhǎng)黑青稞干樣品中阿魏酸的物質(zhì)的量表示，單位為μmol/g md。

1.3.5 黃酮含量測(cè)定

黃酮含量參考Kamiloglu等[18]的方法，利用AlCl3比色法進(jìn)行含量測(cè)定。以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果用每克長(zhǎng)黑青稞干樣品中兒茶素的物質(zhì)的量表示，單位為μmol/g md。

1.3.6 體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基清除能力（DPPH radical scavenging activity，DRSA）的測(cè)定參照鄒青飛等[17]的方法，主要步驟如下：吸取適量的樣品溶液，加入4 mL DPPH-甲醇溶液（20 mL 0.079 mmol/L DPPH-甲醇溶液加入40 mL甲醇），混合，室溫下避光反應(yīng)10 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，DPPH自由基清除率按公式（1）計(jì)算。所得結(jié)果用每克長(zhǎng)黑青稞干樣品中阿魏酸的物質(zhì)的量表示，DRSA單位為μmol/g md。

式中：A0為DPPH-甲醇溶液吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.3.6.2 鐵離子還原/抗氧化能力測(cè)定

鐵離子還原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定參照鄒青飛等[17]的方法，主要步驟如下：吸取適量的樣品溶液，加入3 mL FRAP溶液（10 mL 300 mmol/L乙酸、1 mL 20 mmol/L六水三氯化鐵和1 mL 10 mmol/L三吡啶基三嗪），混合，于37 ℃反應(yīng)4 min，用乙醇作為空白，在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用FeSO4制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝6.24x+0.000 5（R2＝0.998）。式中：y為吸光度；x為硫酸亞鐵濃度/（mmol/L）。所得結(jié)果用每克長(zhǎng)黑青稞干樣品中Fe2+的物質(zhì)的量表示，F(xiàn)RAP單位為μmol/gmd。

1.3.6.3 H2O2清除能力測(cè)定

H2O2清除能力（hydrogen peroxide scavenging activity，HPSA）測(cè)定參照鄒青飛等[17]的方法，主要步驟如下：吸取適量的樣品溶液，依次加入0.75 mL 45 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 7.4）和0.5 mL 40 mmol/L的H2O2，混合，30 ℃下避光反應(yīng)40 min，用乙醇作為空白，在230 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用阿魏酸制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝47.338x+32.772（R2＝0.998）。式中：y為H2O2清除率/%；x為阿魏酸濃度/（μmol/L）。所得結(jié)果用每克長(zhǎng)黑青稞干樣品中阿魏酸的物質(zhì)的量表示，單位為μmol/gmd。H2O2清除率按公式（2）計(jì)算。

式中：A0為H2O2吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.3.6.4 總抗氧化能力測(cè)定

總抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）測(cè)定參考鄒青飛等[17]的方法，主要步驟如下：吸取適量的樣品溶液，加入1.9 mL ABTS陽(yáng)離子工作液，混合，室溫反應(yīng)6 min，用乙醇作為空白，于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用Trolox制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為：y＝103.95x+1.566 3（R2＝0.998）。式中：y為ABTS陽(yáng)離子自由基清除率/%；x為Trolox濃度/（mmol/L）。所得結(jié)果用每克長(zhǎng)黑青稞干樣品中Trolox的物質(zhì)的量表示，TEAC單位為μmol/gmd。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按公式（3）計(jì)算。

式中：A0為ABTS陽(yáng)離子工作液吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.3.6.5 還原能力測(cè)定

還原能力（reducing power，RP）測(cè)定參考鄒青飛等[17]的方法，主要步驟如下：吸取適量的樣品溶液，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液、2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% TCA溶液，4 000 r/min離心10 min得到上清液。吸取上清液1 mL，分別加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3溶液和2.5 mL蒸餾水，用乙醇作為空白，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用抗壞血酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為：y＝0.045 5x-0.115（R2＝0.991 6）。式中：y為吸光度；x為抗壞血酸濃度/（μmol/L）。所得結(jié)果用每克長(zhǎng)黑青稞干樣品中抗壞血酸物質(zhì)的量表示，RP單位為μmol/gmd。

1.3.7 多酚化合物的生物有效性

參照文獻(xiàn)[3]的方法計(jì)算酚類化合物的生物有效性。模擬胃腸道消化和結(jié)腸發(fā)酵后酚類化合物的生物有效性按公式（4）計(jì)算，抗氧化活性的生物有效性按公式（5）計(jì)算。

1.3.8 酚類化合物的組成分析

利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分析長(zhǎng)黑青稞在胃腸道消化和結(jié)腸發(fā)酵過程中的酚類化合物組成。色譜條件：色譜柱為 Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、流動(dòng)相流速0.8 mL/min、柱溫30 ℃、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；梯度洗脫程序：0 min，體積分?jǐn)?shù)5%甲醇-水溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸）；20 min，體積分?jǐn)?shù)95%甲醇-水溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸）；21 min，體積分?jǐn)?shù)5%甲醇-水溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸）；25 min，體積分?jǐn)?shù)5%甲醇-水溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過單因素方差分析和Tukey’s多重比較方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬胃腸道消化過程中青稞酚類化合物含量和抗氧化活性

表1 胃腸消化后青稞中酚類化合物含量和抗氧化活性Table 1 Phenolic contents and antioxidant activity of hulless barley before and after gastrointestinal digestion

由表1可以看出，體外模擬胃腸道消化后，青稞中總酚和類黃酮含量呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)。在胃消化階段，與未消化樣品相比，總酚和類黃酮含量呈降低趨勢(shì)，這與Ortega[12]、Shu Yang[19]等的研究結(jié)果相一致。原因可能是未消化樣品采用70%丙酮進(jìn)行化學(xué)提取后再進(jìn)行含量測(cè)定，而胃消化階段直接取消化液上清液進(jìn)行測(cè)定[20]；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在胃消化條件下酚類和類黃酮化合物的穩(wěn)定性較差[18]。在胃腸消化階段，總酚和類黃酮含量顯著增加（P＜0.05），分別為（32.73±6.45）μmol/gmd和（1.23±0.06）μmol/gmd，與胃消化階段相比，分別提高了191.45%和261.76%；與未消化樣品相比，分別提高了92.87%和13.89%。不同的體外抗氧化測(cè)定方法由于原理不同，其測(cè)定結(jié)果有所差異，但是為了較為客觀全面地評(píng)價(jià)某種物質(zhì)的抗氧化活性，一般采用多種方法進(jìn)行測(cè)定[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，與未消化階段相比，胃腸道消化后，除RP外，DRSA、FRAP、HPSA和TEAC測(cè)定的抗氧化活性均得到提高。多酚能夠與食物中蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子通過共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵相結(jié)合[21]，在胃腸消化過程中，酸堿環(huán)境和各種消化酶的作用有利于多酚從食物基質(zhì)中釋放出來，使總酚和類黃酮含量以及抗氧化活性得到提高[22]。根據(jù)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，總酚和類黃酮含量與抗氧化活性可能存在一定的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，小麥不同部位（全麥、麩皮和精面）經(jīng)過體外模擬胃腸道消化以后，總酚和類黃酮含量升高，抗氧化活性增強(qiáng)[23]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。

2.2 體外模擬胃腸道消化后青稞中酚類化合物和抗氧化活性的生物有效性

表2 胃腸消化后青稞中酚類化合物和抗氧化活性的生物有效性Table 2 Bioavailability of phenolic compounds and antioxidant activity in hulless barley after gastrointestinal digestion%

由表2可以看出，總酚、類黃酮和抗氧化活性的生物有效性與其含量的變化具有相似的趨勢(shì)。在胃消化階段，與未消化樣品相比，總酚和類黃酮的生物有效性降低。在胃腸消化階段，總酚和類黃酮的生物有效性分別為（193.17±40.04）%和（114.97±16.36）%，與胃消化階段相比，分別提高126.96%和83.72%；與未消化樣品相比，總酚和類黃酮的生物有效性分別提高93.17%和14.97%。胃腸道消化后，DRSA、FRAP、HPSA和TEAC的生物有效性顯著升高（P＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)通過對(duì)不同的谷物樣品[9]和馬鈴薯及甘薯[10]體外模擬胃腸道消化后，酚類化合物和抗氧化活性的生物有效性得到提高，與本研究結(jié)果一致。原因可能是在胃腸道消化過程中，酚類化合物可以從食物基質(zhì)中釋放出來，導(dǎo)致生物有效性升高[22]，同時(shí)不溶性結(jié)合酚類化合物與食物基質(zhì)的相互作用會(huì)影響酚類化合物的溶解性和有效性，進(jìn)一步影響到酚類化合物的生物有效性[24]。

2.3 體外結(jié)腸發(fā)酵過程中青稞多酚化合物含量和抗氧化活性

表3 結(jié)腸發(fā)酵后青稞中酚類化合物含量和抗氧化活性Table 3 Phenolic contents and antioxidant activity in hulless barley after colon fermentation

由表3可以看出，經(jīng)體外結(jié)腸發(fā)酵后，青稞中總酚和類黃酮含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)。在結(jié)腸發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚和類黃酮含量顯著增加（P＜0.05），在30 h達(dá)到最高值，分別為（20.25±2.07）μmol/gmd和（0.72±0.11）μmol/gmd，與發(fā)酵0 h相比，分別提高了1 173.58%和620.00%；發(fā)酵至4 8 h，總酚和類黃酮含量呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化活性與多酚含量具有顯著的線性關(guān)系[16]。由表3可知，在體外結(jié)腸發(fā)酵過程中，抗氧化活性與酚類化合物含量具有類似的變化趨勢(shì)，在發(fā)酵前30 h，5 種方法測(cè)定的抗氧化活性均呈增加趨勢(shì)，在30 h時(shí)達(dá)到最高，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化活性顯著降低（P＜0.05）。青稞中不可溶鍵合多酚能夠與細(xì)胞壁多糖和蛋白質(zhì)等成分以共價(jià)鍵、氫鍵和疏水鍵結(jié)合，在結(jié)腸微生物酶的作用下，與多酚相連的化學(xué)鍵被打斷，多酚得以釋放出來，導(dǎo)致總酚和類黃酮含量提高，抗氧化活性增強(qiáng)[18]。但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)腸微生物可將多酚化合物進(jìn)一步降解和轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，同時(shí)微生物在生長(zhǎng)過程中可以吸收利用酚類化合物，導(dǎo)致總酚、類黃酮含量和抗氧化活性逐漸降低[25]。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)谷物面包[26]和角豆粉[12]進(jìn)行體外結(jié)腸發(fā)酵，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酚類化合物含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相一致。在體外結(jié)腸發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，黑米和鷹嘴豆的抗氧化活性呈降低趨勢(shì)[27]，巴西莓的抗氧化活性呈升高的趨勢(shì)[28]，重度烘焙咖啡殘?jiān)目寡趸钚猿氏壬吆蠼档偷内厔?shì)[13]，說明在發(fā)酵過程中，發(fā)酵食品種類以及抗氧化活性測(cè)定方法對(duì)抗氧化活性都會(huì)存在影響。

2.4 體外結(jié)腸發(fā)酵后青稞中酚類化合物和抗氧化活性的生物有效性

表4 結(jié)腸發(fā)酵后青稞中酚類化合物和抗氧化活性的生物有效性Table 4 Bioavailability of phenolic compounds and antioxidant activity in hulless barley after simulated colon fermentation in vitro%

由表4可以看出，經(jīng)體外結(jié)腸發(fā)酵后，青稞中總酚、類黃酮和抗氧化活性的生物有效性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。發(fā)酵前30 h，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚、類黃酮和抗氧化活性的生物有效性逐漸增加；在30 h時(shí)，總酚和類黃酮的生物有效性均達(dá)到最大值，分別為（119.49±13.89）%和（67.53±17.43）%，與發(fā)酵0 h相比，分別提高了110.14%和58.70%；之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚、類黃酮和抗氧化活性的生物有效性顯著降低（P＜0.05）。在結(jié)腸發(fā)酵過程中，酚類化合物在微生物酶的作用下被釋放出來，導(dǎo)致生物有效性升高，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酚類化合物被微生物進(jìn)一步分解和代謝，造成生物有效性降低[25]。研究發(fā)現(xiàn)，重度烘焙咖啡殘?jiān)?jīng)體外發(fā)酵后，酚類化合物和抗氧化活性的生物有效性呈先升高后降低的趨勢(shì)[13]，與本研究結(jié)果相一致。

2.5 體外胃腸道消化液和結(jié)腸發(fā)酵液中酚類化合物的組成及含量

利用HPLC測(cè)定了胃腸道消化不同階段和結(jié)腸發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)酚類化合物的組成，通過對(duì)比18 種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積，確定樣品中酚類化合物的組成及含量，結(jié)果見表5和表6。

由表5可以看出，青稞經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，在消化液中鑒定出18 種酚類化合物，分為羥基苯甲酸、羥基肉桂酸和類黃酮3 類。在胃腸道消化過程中，酚類化合物呈現(xiàn)出3 種不同的變化趨勢(shì)，其中，沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草醛、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、表兒茶素、槲皮素和山柰酚含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)；香草酸、丁香酸、表沒食子兒茶素、楊梅素和芹菜素含量總體呈降低的變化趨勢(shì)；兒茶素含量呈升高的變化趨勢(shì)。含量升高的原因可能是某些酚類化合物能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，在胃蛋白酶的作用下，酚類化合物得到釋放，導(dǎo)致含量升高[18]；含量下降的原因可能是在胃腸道消化過程中，pH值和消化酶均會(huì)對(duì)酚類化合物的穩(wěn)定性造成影響，導(dǎo)致某些酚類化合物在消化過程中含量降低[29]。研究發(fā)現(xiàn)，利用柿子果實(shí)進(jìn)行體外模擬胃腸道消化后，大部分酚類化合物含量在胃消化階段增加，之后在胃腸消化階段含量降低[30]；不同堅(jiān)果經(jīng)過胃腸道消化后，酚類化合物也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)[31]，與本研究結(jié)果相一致。

表5 胃腸道消化后青稞中酚類化合物的組成Table 5 Composition of phenolic compounds in hulless barley after gastrointestinal digestionμg/g md

由表6可以看出，青稞經(jīng)體外結(jié)腸發(fā)酵后，在發(fā)酵液中鑒定出18 種酚類化合物，分為羥基苯甲酸、羥基肉桂酸和類黃酮3 類。在結(jié)腸發(fā)酵過程中，酚類化合物含量呈現(xiàn)出3 種變化趨勢(shì)，第一種總體呈先升高后降低的趨勢(shì)，包括沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、香草醛、綠原酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素、山柰酚和芹菜素；第二種總體呈上升趨勢(shì)，包括丁香酸、肉桂酸、兒茶素、楊梅素；第三種總體呈降低趨勢(shì)，包括咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸和槲皮素。含量呈現(xiàn)上升的原因可能是：一方面，在結(jié)腸微生物酶的作用下，酚類化合物能夠從青稞基質(zhì)中釋放出來，導(dǎo)致含量升高；另一方面，某些酚類化合物可以通過生物轉(zhuǎn)化，形成新的酚類化合物，導(dǎo)致該酚類化合物含量上升[18]。如咖啡酸在微生物的作用下可以轉(zhuǎn)化為阿魏酸，可使阿魏酸含量升高；沒食子酸在微生物的作用下可以轉(zhuǎn)化為原兒茶酸，可使原兒茶酸的含量升高[30]。含量呈現(xiàn)下降的原因可能是在結(jié)腸微生物酶的作用下，某些酚類化合物可以轉(zhuǎn)化和代謝為其他化合物，導(dǎo)致含量降低。如芹菜素在腸道微生物的作用下可能代謝為柚皮素，導(dǎo)致其含量降低；綠原酸在腸道微生物的作用下可能代謝為苯甲酸，也引起含量降低[29]。

表6 結(jié)腸發(fā)酵后青稞中酚類化合物的組成Table 6 Composition of phenolic compounds in hulless barley after colon fermentation μg/g md

3 結(jié) 論

青稞經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，與未消化樣品相比較，總酚、類黃酮含量和抗氧化活性均升高，生物有效性得到提高。在體外結(jié)腸發(fā)酵前30 h，總酚、類黃酮含量和抗氧化活性呈顯著增加，生物有效性也顯著增強(qiáng)；但發(fā)酵30 h后，總酚、類黃酮含量和抗氧化活性逐漸降低，導(dǎo)致生物有效性下降，原因可能是在結(jié)腸微生物的作用下，酚類化合物可進(jìn)一步分解為其他化合物，同時(shí)微生物在生長(zhǎng)過程中可以吸收利用酚類化合物。說明經(jīng)結(jié)腸發(fā)酵后釋放的鍵合多酚以及酚類化合物的生物有效性可為青稞促進(jìn)人體健康提供理論依據(jù)。