合成型酵母基因組重排技術

張慧 田方方 吳毅

（1. 天津大學 教育部合成生物學前沿科學中心，天津 300072；2. 天津化學化工學院，天津 300072）

基因組變異為物種進化提供了動力。基因組變異的類型主要有單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）、插入缺失（Indels）、結構變異（Structural variation，SVs）。基因組的結構變異包括片段缺失、重復、相互移位和反轉等，其包含更多的遺傳變異信息?；蚪M結構變異已經被廣泛的認為與物種進化、個體間遺傳差異、人類疾病以及大量的表型變異相關［1-4］。設計染色體和基因組的全合成是遺傳學和生物學研究的新范式，釀酒酵母是真核生物的模式生物，可以作為真核生物染色體系統(tǒng)研究的平臺，以驗證和拓寬我們對生物體的認知。全化學合成的釀酒酵母染色體上具有對稱的loxP 位點，基于Cre-loxP 反應的基因組重排技術可以產生DNA 片段的刪除、反轉、復制、移位等不同組合的染色體結構變異，實現(xiàn)全基因組序列的重排，豐富了基因型多樣性。本文介紹了最近合成型酵母基因組重排的技術開發(fā)和其創(chuàng)新應用的進展 （圖1）。

圖1 合成型酵母基因組重排技術開發(fā)與創(chuàng)新應用

1 合成型酵母基因組重排

“人工合成釀酒酵母基因組”計劃（Sc2.0）旨在獲得第一個完全化學合成的、具有完整生物活性的真核生物基因組［5-12］。通過在合成型染色體非必需基因終止密碼子后添加對稱的loxP 序列（loxPsym），賦予了基因組柔性可變的功能，可使其間的DNA 片段發(fā)生刪除、反轉、復制、移位等基因組結構變異。

傳統(tǒng)的loxP 序列來自P1 噬菌體，全長共計34 bp，左右兩端為13 bp 反向回文序列，中間為8 bp間隔序列。在Cre 重組酶誘導下兩個loxP 序列之間發(fā)生位點特異性重組，引起序列間DNA 的重排［13-15］。Cre 重組酶基因同樣來自P1 噬菌體，其編碼區(qū)序列全長1 029 bp，編碼由343 個氨基酸組成的38 kD 單體蛋白，其能夠特異性地識別loxP 位點。二者共同組成Cre-loxP 重組酶系統(tǒng)。

Sc2.0 采用對稱的loxP 序列（LoxPsym）與Cre酶的相互作用構成了基因組重排系統(tǒng)（Synthetic chromosome rearrangement and modification by loxPmediated evolution，SCRaMbLE）。通過誘導Cre 酶的表達，可以實現(xiàn)loxP 序列間DNA 片段的刪除、反轉、復制、移位等基因組結構變異。利用基因組重排技術可以實現(xiàn)全基因組范圍內的DNA 片段重排，從而可以產生大量不同基因型和表型的酵母菌株，快速獲得豐富的酵母文庫。

2 合成型酵母基因組重排技術進展

2.1 技術開發(fā)

2.1.1 基因組重排的精準控制與篩選技術 傳統(tǒng)的單純依賴雌激素誘導的Cre 重組酶表達系統(tǒng)在實驗中被證明了其局限性，在沒有雌激素誘導的情況下仍會出現(xiàn)因Cre 酶泄露造成的合成型染色體穩(wěn)定性降低甚至致死現(xiàn)象，因而精準控制基因組重排過程對于產生基因型多樣性和具有特定優(yōu)勢的物種至關重要。精準控制基因組重排可以通過“與門”開關或光控制來實現(xiàn)。以合成型釀酒酵母5 號染色體（synV）為研究對象，Jia 等［16］構建了一個半乳糖驅動的Cre-EBD 作為 “與門”基因開關，用于精確控制合成型單倍體和二倍體酵母發(fā)生基因組重排?！芭c門”開關pCRE4（pGal1-Cre-EBD-tCYC1）通過組合轉錄水平和Cre-EBD 的細胞核定位水平調節(jié)Cre酶活性，精準控制重排系統(tǒng)的開關。只有在半乳糖誘導pGal1 啟動子表達和雌二醇誘導Cre 酶表達同時發(fā)生時，“與門”開關pCRE4 才能開啟基因組的重排，從而達到精準控制的目的［17-18］。Hochrein等［19］開發(fā)了一種光控制的Cre 重組酶誘導系統(tǒng)（L- SCRaMbLE），并將其應用于控制基因組重排。L- SCRaMbLE 技術基于分裂的蛋白而設計，其中Cre 酶的N 端和C 端被分裂并分別與來自擬南芥的發(fā)色團結合光感受器（PhyB）及其相互作用因子（PIF3）兩種異源蛋白融合，經紅光照射后兩種植物蛋白相互作用以重建Cre 重組酶使其恢復功能。應用L- SCRaMbLE 技術可有效應對Cre 酶泄露帶來的問題，并可通過誘導時間、光劑量和感受器濃度微調Cre重組酶的活性，進而精準控制基因組重排。

基因組重排技術可以產生大量的基因組結構變異并獲得龐大的菌株庫，有效的篩選方法是獲得目標菌株的必要途徑。Luo 等［20］開發(fā)出一種高效篩選重組細胞的報告系統(tǒng)，即ReSCuES。該系統(tǒng)基于loxP 介導的兩個營養(yǎng)缺陷型標簽（URA3 和LEU2）的交替“開/關”，兩個營養(yǎng)缺陷標簽的開放閱讀框彼此相鄰且對向排列形成一個“URA3-LEU2”模塊，其兩側具有兩個對稱的loxP 位點。Cre 重組酶誘導一次基因組重排導致模塊倒置，打開LEU2 的表達同時關閉URA3 的表達。借助該報告系統(tǒng)并利用相應的缺陷型培養(yǎng)基可高效篩選已發(fā)生基因組重排菌，縮短了實驗時間并節(jié)省勞力，并且隨著菌株中合成型染色體數(shù)目的增多系統(tǒng)優(yōu)勢有更佳的體現(xiàn)。

2.1.2 合成型酵母基因組重排策略 合成型酵母基因組重排新策略包括雜合二倍體與跨物種基因組重排、多輪迭代基因組重排、環(huán)形染色體重排、體外DNA 重排、整合基因組重排等。

Shen 等開發(fā)了雜合二倍體與跨物種基因組重排策略，通過將含有單條合成型染色體（synX）和含有兩條合成型染色體（synV and synX）的單倍體酵母與來自酵母菌株庫（SGRP）的野生型釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和野生型奇藝酵母（Saccharomyces paradoxus）單倍體交配，獲得了雜合二倍體和跨物種二倍體［9-10，21-23］。通過基因組重排技術的驅動進行基因組重排，獲得了多達100 株的雜合二倍體和跨物種二倍體菌株庫，結果表明在二倍體中進行基因組重排操作，菌株的存活率比在單倍體中更高。

為了持續(xù)驅動釀酒酵母表型進化，Jia 等［16］將釀酒酵母二倍體和單倍體交替的生活史與基因組重排技術相結合開發(fā)了一種多輪迭代的基因組重排技術（MuSIC）。通過一輪重排后篩選得到的高產二倍體酵母的高產孢子與其他合成型單倍體酵母交配，再進行下一輪基因組重排，這樣的多輪循環(huán)可以快速積累大量重排。多輪迭代技術的建立實現(xiàn)了基因組結構的持續(xù)進化。

此外，染色體拓撲結構也對染色體重排起著重要作用，Xie 等［9］合成了環(huán)形釀酒酵母5 號染色體（ring_syn Ⅴ），其全長534 637 bp，端粒被去除并被170 個loxPsym 位點分割成170 個片段。Wang 等［24］對ring_syn Ⅴ應用基因組重排技術進行基因組重排，發(fā)現(xiàn)環(huán)形染色體可以發(fā)生大規(guī)模復制，經過5 輪迭代基因組重排技術，合成型環(huán)形染色體增加的長度多達原長的一倍以上。此外，合成型環(huán)形染色體在基因組重排過程中還能夠發(fā)生染色體數(shù)目變異，形成了染色體數(shù)目非整倍的菌株。借助合成型環(huán)形染色體的基因組重排技術，可以驅動染色體連續(xù)地產生復雜的基因型并得到相應表型，從而可以有效擴大結構變異的規(guī)模和數(shù)量。

隨著DNA 合成和組裝技術的快速發(fā)展，合成型DNA 在異源代謝通路和合成型基因組的從頭設計和構建方面有了新的應用［7，25］。Wu 等［26］設計開發(fā)了一種體外DNA 基因組重排技術，利用Cre 重組酶與包含多個loxPsym 位點DNA 的相互作用，可以在試管內實現(xiàn)DNA 的高效重排。研究者提出了“自上而下”和“自下而上”的兩種代謝通路優(yōu)化策略?！白陨隙隆钡幕蚪M重排技術采用純化的DNA 重組酶對編碼多個loxPsym 位點的DNA 結構進行基于重排的優(yōu)化。通過對基因組重排技術后的pLM495 文庫進行 PacBio 測序，共確定了94 個獨特的通路結構，這些通路展現(xiàn)了crtI、crtE、crtYB和tHMG1四個基因基于多個loxPsym 位點發(fā)生的可測得的重排事件；將pLM495 直接轉化進釀酒酵母進行表型檢測，得到了包括刪除、反轉和復制在內的17 種獨特的β-胡蘿卜素代謝途徑結構。借助體外DNA 重排技術可實現(xiàn)在體外建立結構變異文庫，為快速實現(xiàn)異源代謝通路的優(yōu)化提供了一種有效方法。Liu 等［27］開發(fā)了一種基于重組酶的整合基因組重排技術（稱為“SCRaMbLE-in”）。在體外將調節(jié)元件、選定的重組酶和靶途徑DNA 混合后，調節(jié)元件可通過重組酶整合進靶重組位點上以產生一個組裝代謝路徑庫。隨后借助基因組重排技術將組裝路徑整合到合成型酵母基因組中，同時重組酶可誘導底盤細胞發(fā)生基因組重排。利用SCRaMbLE-in 可以只通過兩步反應，達到同時實現(xiàn)基因表達的多樣化和底盤細胞的工程化的效果，快速優(yōu)化宿主以更好地適應異源途徑以及優(yōu)化外源途徑在細胞內表達，最終實現(xiàn)快速代謝工程。

2.2 合成型酵母基因組重排技術的應用

2.2.1 合成型酵母基因組重排技術提升細胞工廠產量 不同的基因組重排技術策略（體內、體外；線型、環(huán)型；單倍體、二倍體）驅動的合成型染色體重排可產生大量的基因組結構變異，推動酵母菌株庫的產生，進而從中篩選出細胞工廠產量提升的酵母菌株。目前已經可以利用基因組重排技術提升類胡蘿卜素、紫色桿菌素及青霉素等的產量［16，24，26，28］。

Jia 等［16］利用獨特的“與門”基因開關調節(jié)Cre 酶的活性，對單倍體菌株使用精準控制基因組重排系統(tǒng)生產類胡蘿卜素，通過全基因組測序證明了合成型五號染色體上YEL013W 的缺失可以提升類胡蘿卜素的產量。進一步對二倍體酵母應用MuSIC，經過5 輪迭代重排累積多個染色體重排使生產菌株快速進化，最終使類胡蘿卜素產量提升38.8 倍。Wu等［26］利用體外DNA 重排系統(tǒng)來優(yōu)化酵母細胞內源表達的β-胡蘿卜素代謝通路，使β-胡蘿卜素產量增加了5.1 倍，并發(fā)現(xiàn)了CrtI基因是該代謝通路的關鍵基因，該基因的復制和反轉都可以使β-胡蘿卜素產量提高。

Wang 等［24］對含有合成型環(huán)形五號染色體的紫色桿菌素前體物（PDV）生產菌進行多輪誘導重排，一共得到53 個新的結構連接。將其中29 個新的連接位點整合到釀酒酵母中使PDV 產量增加了約3.48倍，表明環(huán)形染色體重排產生的全新結構變異與PDV 的產量上升有關。Blount 等［28］將外源代謝通路整合進酵母細胞中，通過合成型五號染色體的體內 基因組重排得到紫色桿菌素高產菌株。此外，還得到了青霉素高產菌株，將青霉素產量提高了近2 倍。研究者將基因組重排技術與納米孔測序技術相結合，從而快速鑒定基因組結構變異，獲得了更高的產率。

2.2.2 合成型酵母基因組重排技術提高底盤細胞耐受性 使用基因組重排技術可以驅動菌株快速進化，在不同的環(huán)境壓力中篩選獲得適應性菌株。可以增加底盤細胞對乙醇、乙酸、咖啡因、木糖等物質的耐受性，或增強其在堿性、高溫等環(huán)境下的生活 能力［20-21，28-29］。

Luo 等［20］對分別含有合成型12 號和3 號染色體的酵母細胞進行基因組重排，利用ReSCuES 篩選策略，最終得到了乙醇耐受性增加且遺傳穩(wěn)定的菌株，證明了ACE2的丟失導致乙醇耐受性的增加。此外，研究者還利用ReSCuES 篩選出了耐乙酸的優(yōu)勢菌株。Shen 等［21］基于奇藝酵母CBS5829 對咖啡因的相對耐受性，通過跨物種二倍體CBS5829-synX和CBS5829-synVsynX 的基因組重排，成功獲得十株咖啡因耐受性提升的重排菌株，全基因組測序和驗證實驗顯示POL32基因拷貝數(shù)的增加與咖啡因耐受性的提升有關。Blount 等［28］將木糖利用的異源途徑引入帶有合成型五號染色體的釀酒酵母，通過基因組重排成功獲得一株在以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長增強的菌株。

Ma 等［29］以含有一條合成型5 號染色體的酵母菌株和同時含有5 號、10 號兩條合成型染色體的酵

母菌株為研究對象，通過Cre-EBD 重組酶誘導進行多次獨立的基因組重排，驅動合成型酵母菌株的快速進化。在pH 為8.0 的堿性環(huán)境下篩選到了7 株耐堿性提高的菌株，全基因組測序并通過實驗驗證發(fā)現(xiàn)YER161C 的缺失與菌株耐堿性的提高有關。Shen等［21］以釀酒酵母Y12 為研究對象，通過雜合二倍體Y12-synX 的基因組重排，成功獲得了兩株耐受42℃高溫的菌株。Luo 等［20］利用ReSCuES 篩選出了耐高溫的優(yōu)勢菌株。

2.2.3 合成型酵母基因組重排技術揭示進化規(guī)律 遺傳變異對于揭示進化規(guī)律和遺傳改造具有重要意義，但目前我們對遺傳變異的認識主要局限于SNPs 和indels，對于大尺度的基因組結構變異特別是復制、反轉和移位的研究還相對不足［1］。Li 等［30］以含有合成型釀酒酵母和奇藝酵母染色體的雜合二倍體菌株為研究對象，使用基因組重排技術驅動合成型雜合酵母菌株重排，通過全基因組測序分析，在進化菌株中檢測到不同尺度的雜合性缺失事件。實驗結果揭示出合成型五號染色體上基因GLN3的缺失，以及合成型十號染色體全染色體雜合性缺失與酵母雷帕霉素耐受性相關。研究者通過快速適應性進化同樣獲得了雷帕霉素耐受菌株，發(fā)現(xiàn)了八號染色體的拷貝數(shù)增加。這表明基因組重排為基因組結構變異與進化的研究提供了一種新思路。

3 展望

到目前為止，合成釀酒酵母基因組計劃已經完成了6 條酵母染色體的化學合成，未來將得到含有完整的16 條合成型染色體的人工酵母基因組［32］。全合成型的人工酵母基因組進行基因組重排后，將會產生更多具有不同基因型的酵母菌株庫，為提升生產菌種性能、優(yōu)化底盤細胞和異源途徑的適配提供更多可能?；蚪M重排技術方興未艾，在技術和應用方面還在不斷拓展。目前的基因組重排技術僅限于合成型釀酒酵母菌株，因而將基因組重排技術的研究對象從釀酒酵母這一模式生物擴展到其他工業(yè)相關的酵母菌、原核乃至高等真核生物是未來基因組重排技術發(fā)展的重要方向。另外，基因組重排技術與其他技術（如CRISPR-Cas9 技術、傳統(tǒng)的誘變技術）的結合，可以提供多尺度的基因組變異的方式，在基礎研究、醫(yī)療健康、工業(yè)生產、生物資源等領域擁有巨大的發(fā)展前景。